GB/T 27635-2011
基本信息
标准号： GB/T 27635-2011
中文名称：斑点叉尾鮰嗜麦芽寡养单胞菌检测操作方法
标准类别：国家标准(GB)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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标准分类号
关联标准
出版信息
相关单位信息
标准简介
GB/T 27635-2011 斑点叉尾鮰嗜麦芽寡养单胞菌检测操作方法
GB/T27635-2011
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标准内容
ICS 11. 220
中华人民共和国国家标准
GB/T 27635—-2011
斑点又尾嗜麦芽寡养单胞菌
检测操作方法
Protocol of identificalion of Stenotrophoonas maitoptilia from Ictaluruspnctatus Rafinsque
2011-12-30 发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
2012-04-01实施
本标准按照GB/T1.1—2009的规则起草。本标准由中华人民共和国农业部提出本标准由全国动物防疫标准化技术委员会(SAC/TC181)归口。GB/T 276352011
本标准起草单位：中华人民共和国江苏出人境检验检疫局、中国动物卫生与流行病学中心。本标准主要起草人，薛峰、蒋原、袁芳、王云飞、张容、易海华、徐帮兴、邵卫星、马卉、栾军、陈国强、乔华林、谢怀根。
TTTKAONKACA
1范围
斑点尾鲫麦芽基养单胞菌
检测操作方法
本标准规定了斑点叉尾颤嗜麦芽寡养单胞菌的分离与婆定方法。本标准适用于对斑点义尾網的嗜麦芽赛养单胞菌的分商、鉴定。2规范性引用文件
GB/T 27635—2011
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注口期的引用文件,其最新版本(包括所有的改单)适用于本文件。GB/T4789.28—2003食品卫生微生物学验染色法，培养基和试剂GB/T6682—2008分析实验案用水规格和试验方法3缩略语
下列缩略语适用于本文件。
NA：nutrientagar，通营养琼脂。TsA：tryptogesoya agar，大豆肤蛋白陈琼脂。VIA；amphutericinBimipenem;vancotnycinhydrochloride，含有万古霉素，亚胺培南，两性霉素B的选挥性平板。
4设备和材料
4. 1 冰箱:0 ℃4 。
恒温培养箱：28℃士1℃。
4.3铂/铱接种环或玻璃棒。
4.4滤纸。
4.5发酵管。
4.6天平：0g~-100，特确至0.5g。均质器或灭菌乳钵。
4.8灭菌广口瓶500mL
灭菌三角烧瓶:500 mL,250 ml.。4.10
灭菌塔养血：直径90cm。
显微镜：10×~~100×。
试剂和培养基
5.1试剂级别：除另有规定，本方法试验用水应符合GB/T6682--2008规定的二水，所用化学试剂1
TTKANYKAA
GB/T 27635—2011
势为分析纯。
5.2普通营养肉汤、大豆胰蛋白陈脂(TSA)、普通营养琼脂(NA)、普通羊血营养琼脂和 VIA 的配制见附录A（也可按GB/T4789.28—2003中4.7规定）。5.3革兰氏染色液：按GB/T4789.28—2003中2.2规定，5.4氧化酶试剂:接 GB/T 4789.28—2003中 3.18规定。5.5糖发薛管麦芽糖按 GB/T 4789.28-2003 中 3,2规定。5.6
DNA 酶甲基琼脂:按 GB/T 4789. 28—2003 中 4.51 规定。5.7微量生化反应管:乳糖、水杨苷、乙酸盐、丙酸盐、戊酸盐、丙二酸盐、珀酸盘、延胡索酸盘、L-苹果酸盐,乳酸盐、柠酸盐、2-酮二酸盐、丙酮酸盐生化反应,I-丙氨酸、D-丙氨酸,L-容氨酸盐、L-组氨酸和L-崩氨酸，按照GB/T4789.28—2003中规定。5.8API20E生化鉴定试剂盒。
6检验程序
斑点叉尾嗜麦芽寡养单胞菌检验程序见图 1。从病鱼肝,肾取样
于 225 ml著通营排肉径中增菌, 28 α±1 ,癌氧培养 24 h
VIA弥脂上划线，28 C±1,高氧培养 24 h批取平板再最未变黄色的可疆菌落种大豆脏强白脉琼脂或通苷非娠肾。 或者抑过羊血琼脂, 29 亡草兰氏柔色
形态观
绪果全郁相符者
报肯阳性
氧化酶
变孕糖氧化实验、DNA
酵反应实验
结果不全禅相符者
报告性
斑点艾尾喧麦芽事养单胞酋检验程序TTKNKAA
API20E
化实墨
7操作步
7.1样品处理液的制备
GB/T 27635—2011
以无菌操作敢出有病症鱼体，直接从鱼体肝，肾等组织中采样。如果是体长小于4cW的幼鱼取整条鱼如果是体长4cm～6cm的鱼取内脏。将鱼体或内脏25g均质于225mL营养肉汤中28℃土1℃带氧培养24h，无菌取培养液作为样品处理液7.2细菌的分离
将 24 h普通营养肉荡增菌被划线接种于 VIA,置 28 C需氧培养 24 h,显微镜观察,背景未变化的单个优势菌落为可凝菌落。
7.3可疑蓝落筛选
挑取背景未变化的单个优势可疑菌落于大臣蛋白陈琼脂或普通营养琼脂或者普通羊血平板，置于28℃氧培养24h。观察菌落的大小、形态。在普通营养琼脂上菌落呈灰白色，圆形，表面光滑，边沿整齐的半透明菌落：在大互胰蛋白豚琼脂（TSA）平板上形成圆形，表面光滑，边缘整齐，直径0.18 mm~1.12 mm的透明的无色菌落;在普通羊血琼脂平板上出现明显的β溶血环,且溶血环号草绿色，有强烈的氨味。符合以上菌落特征的为可疑菌株。7.4嗜麦芽赢养单胞菌的监定
7. 4. 1革兰氏染色
对可疑菌落进行革兰氏染色，嗜麦芽真养单胞菌为G一杆菌，无英膜，无芽孢，极生端鞭毛，鞭毛数不小于2。
7. 4. 2氧化酶实酸
使用铂/嵌接种环或玻璃样，批取单个可疑菌落，然后接种到用氧化酶试剂润混的滤纸上，如果在10s内出现紫红色、紫罗兰或深蓝色为性，不变色为阴性，嗜麦芽寡养单胞菌为阴性。7、4.3麦芽氧化实验
将可疑菌落无阐挑取到麦芽糖发酵管，28℃士1℃培养 2 h～3 h,观察结果。嗜麦芽真养单胞菌为氧化麦芽糖强阳性
7、4.4DNA酶反应实验
在以甲基绿为指示剂的 DNA酶培养基的试管或平血上检测 DNA 酶活性,在该培养基上,围绕DNA酶阳性的细菌关落的周围有一个消亮的环。将可疑菌落接种到,上还DNA酶反应培养基中,28 \℃需氧条件下培养72h，观察结果。嗜麦芽赛养单胞菌为DNA酶反应阳性7. 4. 5其他生化反应
7.4.5.1AP120E监定
对上述均符合的可疑菌株用AP120E生化鉴定试剂条监定，具体操作按照产品说明书进行，TTTKAONYKACA
GB/T 27635-2011
7.4.5.2微量反应生化管实验
除API20E鉴定方法外，也可以刺用微量反应生化管，做乳糖、水杨苷、乙酸盐、内酸盐、戊酸盐、丙二酸盐、珀 盐、延胡索酸盐、I-苹果酸盐、乳酸盐、柠機酸盐、2-酮戊二酸盐、丙酮酸盐、L-丙氨酸、D-丙氨酸、L-谷氨酸盘、L-组氨酸和L-脯氮酸生化实验。嗜麦芽嘉养单胞菌均可以利用上逆有机物·反应均为陷性。
结果报告
可疑菌落全部符合7.4中的报告阳性结果：“检出嗜麦芽赛养单胞菌”，否则报告阴性结果：“未检山嗜麦芽寡养单胞菌”。
TTTKANTKACA
A.1替通营肉汤
A. 1. 1基础培养基成分
蛋白陈
牛肉膏
氣化钳
蒸馏水
A. 1. 2 制备
附泉A
(规范性附染）
培养基与试剂
GB/T 27635—2011
1000 mL
用蒸水济解培养基基础成分，调节pH7.4，选取合适大小的三角瓶分装此基础培养基，121°15 min 高压灭菌。
A. 2大豆胰蛋白陈琼脂(TSA)
A. 2. 1基础培养基成分
植物蛋白陈
蒸馏永
A.2.2配制
1 000 mL
用蒸馏水落解培养基基础成分，调节pH，以确保灭菌后pH为7.2士0.2(25℃），选取合适大小的三角瓶分装此基础培养基，121 ℃ 15 min高压灭菌。A,2. 3制备
当基础养基的温度降至47℃～50℃时混勾。倾注15mL基础培养基于灭菌平血中,静置使凝固。
A.3普通营养琼培养基(NA)
基础培养基成分
蛋白陈
氯化钠
牛肉膏粉
醇母膏粉
GB/T 27635—2011
蒸馏水
A. 3, 2配制
1 000 mL
用蒸馏水溶解培养基基础成分，调节pH，以确保灭菌后pH为7.2士0.2(25℃）,选取合适大小的三角瓶分装此基础培养基,121℃ 15 min高压灭菌。A. 3. 3制备
当基础培养基的温度降至47℃～50℃时，混勾，倾注15mL基础培养基于灾菌平血中，静置使凝固。
A,4普通羊血琼脂
A 4. 1 基础培养基
A. 4. 1. 1 成分
动物组织酵解物
氯化钠
A 4. 1. 2配制
8.0 g~18. 0 g
1 000 nL
将基础组分溶于水,加热以促进溶解。调节pH,使培养基在高压灭菌后，在24℃时的PH为7.3土0.2，选取适当三角瓶进行分装。121℃15min高压灭菌。A.4.2合成培养基
A. 4. 2. 1 组分
basic medium(基础培养基，见A4. 1)steriledefihrinatedhorse/shccpblood（无菌脱纤维马/羊血）A, 4, 2, 2 制备
1 000 mL
当基础培养基的温度降至47℃~50℃时，加入无菌脱纤维马/羊血5mL/100mL，混勾。倾注15 mL合成培养基于灭菌乎血中,静箕使凝固。A.5 VIA
A, 5, 1 基础培养基
A, 5. 1. 1 成分
蛋白陈
牛肉没膏
D-甘露醇
氯化钠
狼百里酚蓝
A.5. 1.2配制
GB/T27635—2011
将基础培养基组分溶于水，加热以促进溶解，调节pH.使培养基在高压灭菌后，在25℃时的pH为7.3士0.2，选适当三角瓶进行分装。121℃15min高压灭菌。A.5.2抗生溶液
A.5.2.1成分
vancamycinhydrochlaride（万古莓素）imipenem（亚胺培南）
amphotericinB两性每衰B)
2制备
用水溶解上述成分并且过滤除菌。A.5.3合成培养基
A.5.3.1成分
基础培养基(见A.5.1),抗生素溶液(见A.5.2)。2制备
5 mg/L
32 mg/L
2. 5 tg/L免费标准bzxz.net
当基础培养基的温度降至 47℃-~50 ℃时,人抗生素溶液,混句,形成合成培养基。倾注 15 rnL此合成培养基丁灭菌平血中，静置使凝固。
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中华人民共和国国家标准
GB/T 27635—-2011
斑点又尾嗜麦芽寡养单胞菌
检测操作方法
Protocol of identificalion of Stenotrophoonas maitoptilia from Ictaluruspnctatus Rafinsque
2011-12-30 发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
2012-04-01实施
本标准按照GB/T1.1—2009的规则起草。本标准由中华人民共和国农业部提出本标准由全国动物防疫标准化技术委员会(SAC/TC181)归口。GB/T 276352011
本标准起草单位：中华人民共和国江苏出人境检验检疫局、中国动物卫生与流行病学中心。本标准主要起草人，薛峰、蒋原、袁芳、王云飞、张容、易海华、徐帮兴、邵卫星、马卉、栾军、陈国强、乔华林、谢怀根。
TTTKAONKACA
1范围
斑点尾鲫麦芽基养单胞菌
检测操作方法
本标准规定了斑点叉尾颤嗜麦芽寡养单胞菌的分离与婆定方法。本标准适用于对斑点义尾網的嗜麦芽赛养单胞菌的分商、鉴定。2规范性引用文件
GB/T 27635—2011
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注口期的引用文件,其最新版本(包括所有的改单)适用于本文件。GB/T4789.28—2003食品卫生微生物学验染色法，培养基和试剂GB/T6682—2008分析实验案用水规格和试验方法3缩略语
下列缩略语适用于本文件。
NA：nutrientagar，通营养琼脂。TsA：tryptogesoya agar，大豆肤蛋白陈琼脂。VIA；amphutericinBimipenem;vancotnycinhydrochloride，含有万古霉素，亚胺培南，两性霉素B的选挥性平板。
4设备和材料
4. 1 冰箱:0 ℃4 。
恒温培养箱：28℃士1℃。
4.3铂/铱接种环或玻璃棒。
4.4滤纸。
4.5发酵管。
4.6天平：0g~-100，特确至0.5g。均质器或灭菌乳钵。
4.8灭菌广口瓶500mL
灭菌三角烧瓶:500 mL,250 ml.。4.10
灭菌塔养血：直径90cm。
显微镜：10×~~100×。
试剂和培养基
5.1试剂级别：除另有规定，本方法试验用水应符合GB/T6682--2008规定的二水，所用化学试剂1
TTKANYKAA
GB/T 27635—2011
势为分析纯。
5.2普通营养肉汤、大豆胰蛋白陈脂(TSA)、普通营养琼脂(NA)、普通羊血营养琼脂和 VIA 的配制见附录A（也可按GB/T4789.28—2003中4.7规定）。5.3革兰氏染色液：按GB/T4789.28—2003中2.2规定，5.4氧化酶试剂:接 GB/T 4789.28—2003中 3.18规定。5.5糖发薛管麦芽糖按 GB/T 4789.28-2003 中 3,2规定。5.6
DNA 酶甲基琼脂:按 GB/T 4789. 28—2003 中 4.51 规定。5.7微量生化反应管:乳糖、水杨苷、乙酸盐、丙酸盐、戊酸盐、丙二酸盐、珀酸盘、延胡索酸盘、L-苹果酸盐,乳酸盐、柠酸盐、2-酮二酸盐、丙酮酸盐生化反应,I-丙氨酸、D-丙氨酸,L-容氨酸盐、L-组氨酸和L-崩氨酸，按照GB/T4789.28—2003中规定。5.8API20E生化鉴定试剂盒。
6检验程序
斑点叉尾嗜麦芽寡养单胞菌检验程序见图 1。从病鱼肝,肾取样
于 225 ml著通营排肉径中增菌, 28 α±1 ,癌氧培养 24 h
VIA弥脂上划线，28 C±1,高氧培养 24 h批取平板再最未变黄色的可疆菌落种大豆脏强白脉琼脂或通苷非娠肾。 或者抑过羊血琼脂, 29 亡草兰氏柔色
形态观
绪果全郁相符者
报肯阳性
氧化酶
变孕糖氧化实验、DNA
酵反应实验
结果不全禅相符者
报告性
斑点艾尾喧麦芽事养单胞酋检验程序TTKNKAA
API20E
化实墨
7操作步
7.1样品处理液的制备
GB/T 27635—2011
以无菌操作敢出有病症鱼体，直接从鱼体肝，肾等组织中采样。如果是体长小于4cW的幼鱼取整条鱼如果是体长4cm～6cm的鱼取内脏。将鱼体或内脏25g均质于225mL营养肉汤中28℃土1℃带氧培养24h，无菌取培养液作为样品处理液7.2细菌的分离
将 24 h普通营养肉荡增菌被划线接种于 VIA,置 28 C需氧培养 24 h,显微镜观察,背景未变化的单个优势菌落为可凝菌落。
7.3可疑蓝落筛选
挑取背景未变化的单个优势可疑菌落于大臣蛋白陈琼脂或普通营养琼脂或者普通羊血平板，置于28℃氧培养24h。观察菌落的大小、形态。在普通营养琼脂上菌落呈灰白色，圆形，表面光滑，边沿整齐的半透明菌落：在大互胰蛋白豚琼脂（TSA）平板上形成圆形，表面光滑，边缘整齐，直径0.18 mm~1.12 mm的透明的无色菌落;在普通羊血琼脂平板上出现明显的β溶血环,且溶血环号草绿色，有强烈的氨味。符合以上菌落特征的为可疑菌株。7.4嗜麦芽赢养单胞菌的监定
7. 4. 1革兰氏染色
对可疑菌落进行革兰氏染色，嗜麦芽真养单胞菌为G一杆菌，无英膜，无芽孢，极生端鞭毛，鞭毛数不小于2。
7. 4. 2氧化酶实酸
使用铂/嵌接种环或玻璃样，批取单个可疑菌落，然后接种到用氧化酶试剂润混的滤纸上，如果在10s内出现紫红色、紫罗兰或深蓝色为性，不变色为阴性，嗜麦芽寡养单胞菌为阴性。7、4.3麦芽氧化实验
将可疑菌落无阐挑取到麦芽糖发酵管，28℃士1℃培养 2 h～3 h,观察结果。嗜麦芽真养单胞菌为氧化麦芽糖强阳性
7、4.4DNA酶反应实验
在以甲基绿为指示剂的 DNA酶培养基的试管或平血上检测 DNA 酶活性,在该培养基上,围绕DNA酶阳性的细菌关落的周围有一个消亮的环。将可疑菌落接种到,上还DNA酶反应培养基中,28 \℃需氧条件下培养72h，观察结果。嗜麦芽赛养单胞菌为DNA酶反应阳性7. 4. 5其他生化反应
7.4.5.1AP120E监定
对上述均符合的可疑菌株用AP120E生化鉴定试剂条监定，具体操作按照产品说明书进行，TTTKAONYKACA
GB/T 27635-2011
7.4.5.2微量反应生化管实验
除API20E鉴定方法外，也可以刺用微量反应生化管，做乳糖、水杨苷、乙酸盐、内酸盐、戊酸盐、丙二酸盐、珀 盐、延胡索酸盐、I-苹果酸盐、乳酸盐、柠機酸盐、2-酮戊二酸盐、丙酮酸盐、L-丙氨酸、D-丙氨酸、L-谷氨酸盘、L-组氨酸和L-脯氮酸生化实验。嗜麦芽嘉养单胞菌均可以利用上逆有机物·反应均为陷性。
结果报告
可疑菌落全部符合7.4中的报告阳性结果：“检出嗜麦芽赛养单胞菌”，否则报告阴性结果：“未检山嗜麦芽寡养单胞菌”。
TTTKANTKACA
A.1替通营肉汤
A. 1. 1基础培养基成分
蛋白陈
牛肉膏
氣化钳
蒸馏水
A. 1. 2 制备
附泉A
(规范性附染）
培养基与试剂
GB/T 27635—2011
1000 mL
用蒸水济解培养基基础成分，调节pH7.4，选取合适大小的三角瓶分装此基础培养基，121°15 min 高压灭菌。
A. 2大豆胰蛋白陈琼脂(TSA)
A. 2. 1基础培养基成分
植物蛋白陈
蒸馏永
A.2.2配制
1 000 mL
用蒸馏水落解培养基基础成分，调节pH，以确保灭菌后pH为7.2士0.2(25℃），选取合适大小的三角瓶分装此基础培养基，121 ℃ 15 min高压灭菌。A,2. 3制备
当基础养基的温度降至47℃～50℃时混勾。倾注15mL基础培养基于灭菌平血中,静置使凝固。
A.3普通营养琼培养基(NA)
基础培养基成分
蛋白陈
氯化钠
牛肉膏粉
醇母膏粉
GB/T 27635—2011
蒸馏水
A. 3, 2配制
1 000 mL
用蒸馏水溶解培养基基础成分，调节pH，以确保灭菌后pH为7.2士0.2(25℃）,选取合适大小的三角瓶分装此基础培养基,121℃ 15 min高压灭菌。A. 3. 3制备
当基础培养基的温度降至47℃～50℃时，混勾，倾注15mL基础培养基于灾菌平血中，静置使凝固。
A,4普通羊血琼脂
A 4. 1 基础培养基
A. 4. 1. 1 成分
动物组织酵解物
氯化钠
A 4. 1. 2配制
8.0 g~18. 0 g
1 000 nL
将基础组分溶于水,加热以促进溶解。调节pH,使培养基在高压灭菌后，在24℃时的PH为7.3土0.2，选取适当三角瓶进行分装。121℃15min高压灭菌。A.4.2合成培养基
A. 4. 2. 1 组分
basic medium(基础培养基，见A4. 1)steriledefihrinatedhorse/shccpblood（无菌脱纤维马/羊血）A, 4, 2, 2 制备
1 000 mL
当基础培养基的温度降至47℃~50℃时，加入无菌脱纤维马/羊血5mL/100mL，混勾。倾注15 mL合成培养基于灭菌乎血中,静箕使凝固。A.5 VIA
A, 5, 1 基础培养基
A, 5. 1. 1 成分
蛋白陈
牛肉没膏
D-甘露醇
氯化钠
狼百里酚蓝
A.5. 1.2配制
GB/T27635—2011
将基础培养基组分溶于水，加热以促进溶解，调节pH.使培养基在高压灭菌后，在25℃时的pH为7.3士0.2，选适当三角瓶进行分装。121℃15min高压灭菌。A.5.2抗生溶液
A.5.2.1成分
vancamycinhydrochlaride（万古莓素）imipenem（亚胺培南）
amphotericinB两性每衰B)
2制备
用水溶解上述成分并且过滤除菌。A.5.3合成培养基
A.5.3.1成分
基础培养基(见A.5.1),抗生素溶液(见A.5.2)。2制备
5 mg/L
32 mg/L
2. 5 tg/L免费标准bzxz.net
当基础培养基的温度降至 47℃-~50 ℃时,人抗生素溶液,混句,形成合成培养基。倾注 15 rnL此合成培养基丁灭菌平血中，静置使凝固。
小提示：此标准内容仅展示完整标准里的部分截取内容，若需要完整标准请到上方自行免费下载完整标准文档。