GB 54139-2010 食品安全国家标准 婴幼儿食品和乳品中维生素A、D、E 的测定 GB54139-2010 标准压缩包解压密码：www.bzxz.net

中华人民共和国国家标准
GB 5413.92010
食品安全国家标准
婴幼儿食品和乳品中维生素A、D、E的测定
National food safetystandardDetermination of vitamin A, D, E in foods for infants and young children.milkandmilkproducts
2010-03-26发布
中华人民共和国卫生部
2010-06-01实施
GB5413.9—2010
本标准代替GB/T5413.9-1997《婴幼儿配方食品和乳粉维生素A、D、E的测定》本标准与GB/T5413.9-1997相比，主要变化如下：抗氧化剂由原来的焦性没食子酸改为抗坏血酸；-将处理方法中的加热回流改为恒温皂化操作：-增加了标准溶液的校正：
-将原有的单点定量改为标准曲线法；-增加了维生素D回收率的测定：将计算公式进行修改。
本标准附录A为规范性附录，附录B为资料性附录，本标准所代替标准的历次版本发布情况为：GB5413-1985、GB/T5413.9-1997I
1范围
食品安全国家标准
GB5413.9—2010
婴幼儿食品和乳品中维生素A、D、E的测定本标准规定了婴幼儿食品和乳品中维生素A、D、E的测定方法。本标准适用于婴幼儿食品和乳品中维生素A、D、E的测定。2规范性引用文件
本标准中引用的文件对于本标准的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本标准。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本标准。3原理
试样皂化后，经石油醚萃取，维生素A、E用反相色谱法分离，外标法定量：维生素D用正相色谱法净化后，反相色谱法分离，外标法定量。4试剂和材料
除非另有规定，本方法所用试剂均为分析纯或以上规格，水为GB/T6682规定的一级水。4.1α-淀粉酶：酶活力≥1.5U/mg4.2无水硫酸钠。
异丙醇：色谱纯。
4.4乙醇：色谱纯。
氢氧化钾水溶液：称取固体氢氧化钾250g，加入200mL水溶解。石油醚：沸程30℃~60℃。
甲醇：色谱纯。
正已烷：色谱纯。
环已烷：色谱纯。
4.10维生素C的乙醇溶液（15g/L）。4.11
维生素A、D、E标准溶液
维生素A标准储备液（视黄醇）（100μg/mL）：精确称取10mg的维生素A标准品，用乙醇（4.4）溶解并定容于100mL棕色容量瓶中。1
GB5413.92010
4.11.2维生素E标准储备液（α-生育酚）（500μg/mL）：精确称取50mg的维生素E标准品，用乙醇（4.4）溶解并定容于100mL棕色容量瓶中。4.11.3维生素Dz标准储备液（100μg/mL）：精确称取10mg的维生素Dz标准品，用乙醇（4.4）溶解并定容于100mL棕色容量瓶中。4.11.4维生素D标准储备液（100μg/mL）：精确称取10mg的维生素D，标准品，用乙醇（4.4）溶解并定容于100mL棕色容量瓶中。注：维生素A、D、E标准储备液均须-10℃以下避光储存。标准工作液临用前配制。标准储备溶液用前需校正，见附录A。
5仪器和设备
5.1高效液相色谱仪，带紫外检测器。5.2旋转蒸发器。
5.3恒温磁力搅拌器：20℃~80℃。5.4氮吹仪。
5.5离心机：转速≥5000转/分钟。5.6培养箱：60℃±2℃。
5.7天平：感量为0.1mg。
6分析步骤
6.1试样处理
6.1.1含淀粉的试样
称取混合均匀的固体试样约5g或液体试样约50g（精确到0.1mg）于250mL三角瓶中，加入1gα淀粉酶（4.1），固体试样需用约50mL45℃～50℃的水使其溶解，混合均匀后充氮，盖上瓶塞，置于60℃±2℃培养箱（5.6）内培养30min。6.1.2不含淀粉的试样
称取混合均匀的固体试样约10g或液体试样约50g（精确到0.1mg）于250mL三角瓶中，固体试样需用约50mL45℃～50℃水使其溶解，混合均匀。6.2测定维生素D的试样需要同时做回收率实验。6.3待测液的制备
6.3.1皂化：于上述处理的试样溶液中加入约100mL维生素℃的乙醇溶液（4.10），充分混匀后加25mL氢氧化钾水溶液（4.5）混匀，放入磁力搅拌棒，充氮排出空气，盖上胶塞。1000mL的烧杯中加入约300mL的水，将烧杯放在恒温磁力搅拌器（5.3）上，当水温控制在53℃±2℃时，将三角瓶放入烧杯中，磁力搅拌皂化约45min后，取出立刻冷却到室温。6.3.2提取：用少量的水将皂化液全部转入500mL分液漏斗中，加入100mL石油醚（4.6），轻轻播动，排气后盖好瓶塞，室温下振荡约10min后静置分层，将水相转入另一500mL分液漏斗中，按上述方法进行第二次萃取。合并醚液，用水洗至近中性。醚液通过无水硫酸钠过滤脱水，滤液收入500mL2
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圆底烧瓶中，于旋转蒸发器上在40℃+2℃充氮条件下蒸至近干（绝不允许蒸干）。残渣用石油醚转移至10mL容量瓶中，定容。
6.3.3从上述容量瓶中准确移取2.0mL石油醚溶液放入试管A中，再准确移取7.0mL石油醚溶液放入另一试管B中，将试管置于40℃+2℃的氮吹仪（5.4）中，将试管A和B中的石油醚吹干。向试管A中加5.0mL甲醇（4.7），振荡溶解残渣。向试管B中加2.0mL正已烷（4.8），振荡溶解残渣。再将试管A和试管B以不低于5000转/分钟的速度离心10min，取出静置至室温后待测。A管用来测定维生素A、E，B管用来测定维生素D。6.4测定
6.4.1维生素A、E的测定
6.4.1.1色谱参考条件
色谱柱：Ci8柱，250mm×4.6mm，5μum，或具同等性能的色谱柱。流动相：甲醇（4.7）。
流速：1.0mL/min。
检测波长：维生素A：325nm；维生素E：294nm。柱温：35℃±1℃。
进样量：20μL。
6.4.1.2维生素A、E标准曲线的绘制分别准确吸取维生素A标准储备液（4.11.1）0.50mL、1.00mL、1.50mL、2.00mL、2.50mL于50mL棕色容量瓶中，用乙醇定容至刻度混匀。此标准系列工作液浓度分别为1.00μg/mL、2.00μg/mL、3.00μg/mL、4.00μg/mL、5.00μg/mL。分别准确吸取维生素E标准储备液（4.11.2）1.00mL、2.00mL、3.00mL、4.00mL、5.00mL于50mL棕色容量瓶中，用乙醇定容至刻度混勾。此标准系列工作液浓度分别为10.0μg/mL、20.0μg/mL、30.0μg/mL、40.0μg/mL、50.0μg/mL分别将维生素A、E标准工作液注入液相色谱仪中（色谱图参见附录B），得到峰高(或峰面积)。以峰高(或峰面积)为纵坐标，以维生素A，E标准工作液浓度为横坐标分别绘制维生素A、E标准曲线。6.4.1.3维生素A、E试样的测定
将试液（6.3.3中A管）注入液相色谱仪中，得到峰高(或峰面积)，根据各自标准曲线得到待测溶液中维生素A、E的浓度。
6.4.2维生素D的测定
6.4.2.1维生素D待测液的净化
6.4.2.1.1色谱参考条件。
色谱柱：硅胶柱，150mm×4.6mm，或具同等性能的色谱柱。流动相：环已烷（4.9）与正已烷（4.8）按体积比1：1混合，并按体积分数0.8%加入异丙醇（4.3）。流速：1mL/min。
波长：264nm。
柱温：35℃±1℃。
进样体积：500μL。
6.4.2.1.2取约0.5mL维生素D标准储备液于10mL具塞试管中，在40℃±2℃的氮吹仪（5.4）上吹干。残渣用5mL正已烷振荡溶解。取该溶液50uL注入液相色谱仪中测定，确定维生素D保留时间。然后将500μL待测液（6.3.3中B管）注入液相色谱仪中，根据维生素D标准溶液保留时间收集维生素D馏分于试管C中。将试管C置于40℃+2℃条件下的氮吹仪中吹干，取出准确加入1.0mL甲醇（4.7），残渣振荡溶解，即为维生素D测定液。
6.4.2.2维生素D测定液的测定
6.4.2.2.1参考色谱条件
色谱柱：Cl8柱，250mmx4.6mm，5um，或具同等性能的色谱柱流动相：甲醇（4.7）。
流速：1mL/min。
检测波长：264nm。
柱温：35℃±1℃。
进样量：100μL。
6.4.2.2.2标准曲线的绘制
GB5413.92010
分别准确吸取维生素Dz（或D，）标准储备液（4.11.3、4.11.4）0.20mL、0.40mL、0.60mL、0.80mL、1.00mL于100棕色容量瓶中，用乙醇定容至刻度混匀。此标准系列工作液浓度分别为0.200ug/mL、0.400μg/mL、0.600μg/mL、0.800ug/mL、1.000μg/mL。分别将维生素D2（或D）标准工作液注入液相色谱仪中，得到峰高（或峰面积)，参见附录B。以峰高(或峰面积)为纵坐标，以维生素D2（或D）标准工作液浓度为横坐标分别绘制标准曲线。6.4.2.2.3维生素D试样的测定
吸取维生素D测定液（6.4.2.1中C管）100μL注入液相色谱仪中（色谱图参见附录B），得到峰高（或峰面积），根据标准曲线得到维生素D测定液中维生素D（或D）的浓度。维生素D回收率测定结果记为回收率校正因子f，代入测定结果计算公式（2），对维生素D含量测定结果进行校正。
7分析结果的表述
7.1维生素A含量的计算
维生素A含量按（1）计算：
X=C×10/2×5x×100
式中：
-试样中维生素A的含量，单位为微克每百克（μg/100g）：X
-从标准曲线得到的维生素A待测液的浓度，单位为微克每毫升（ug/mL)；m——试样的质量，单位为克（g）。注：1μg视黄醇=3.33IU维生素A。以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留三位有效数字。7.2维生素D含量的计算
维生素D含量按（2）计算：
X=×10/7×2×2×100
式中：
X一试样中维生素Dz（或Ds）的含量，单位为微克每百克（ug/100g）：Cs
从标线得到的维生素D2（或D，）待测液的浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）：-试样的质量，单位为克（g)：
（2）
f回收率校正因子。
注：试样中维生素D的含量以维生素D,和D,的含量总和计。GB5413.92010
以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留三位有效数字。3维生素E含量
维生素E含量按（3）计算：
X = C,×10/2×5×100
m×1000
式中：
X试样中维生素E（α-生育酚）的含量，单位为毫克每百克（mg/100g）；Cs
从标准曲线得到的维生素E待测液的浓度，单位为微克每毫升（μg/mL)：m试样的质量，单位为克（g）。以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留三位有效数字。精密度
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值，维生素A、E不得超过算术平均值的5%，维生素D不得超过算术平均值的10%。其他
本标准检出限：维生素A为1μg/100g、维生素E为10.00μg/100g、维生素D为0.20μg/100g5
附录A
（规范性附录）
标准溶液浓度校正方法
维生素A、D、E标准储备液配制后需要进行校正，具体操作如下：GB5413.9—2010
分别取维生素A、D、E标准储备液若干微升，分别注入至含有3.00mL乙醇的比色皿中，根据给定波长测定各维生素的吸光值，按表A.1给定的条件进行测定，通过下列公式计算出该维生素的浓度表A.1各维生素吸光值的测定条件标准品
视黄醇（维生素A）
α-生育酚（维生素E）
麦角钙化笛醇（维生素
胆钙化醇（维生素D，）
浓度计算按式(4)：
式中：
加入标准储备液的量（μL)
V×10-3
比吸光系数E1%
C一维生素A、D、E浓度，单位为克每毫升（g/mL）；维生素A、D、E的平均紫外吸光值：A
-加入标准储备液的量，单位为微升（μL）：-A、D、E维生素1%比色光系数：3.00
Vx10-3
标准储备液稀释倍数。
波长入（nm）
.·(4)
附录B
（资料性附录）
标准品液相色谱图
B.1维生素A、E、D3、D2标准品液相色谱图维生素A、E、D3、D2标准品液相色谱图见图B.1～图B.4。0.
GB5413.9—2010
102304050060070000000100120013001400150010017.0
维生素A标准品液相色谱图
10.0011:001200
13.0014.0015.00
维生素E标准品液相色谱图
GB5413.9—2010
1.00200300405006007.008009.0010001100120013001400150016.0分钟wwW.bzxz.Net
1.002.00 3.00
维生素D标准品液相色谱图
9.0010.0011.0012.0013.0014.00图B.4维生素D标准品液相色谱图E
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