GB/T 18204.4-2013 公共场所卫生检验方法 第4部分:公共用品用具微生物 GB/T18204.4-2013 标准压缩包解压密码：www.bzxz.net

ICS13.060
中华人民共和国国家标准
GB/T18204.4—2013
代替GB/T18204.2~18204.8—2000,GB/T18204.11~18204.12--2000
部分代替GB/T17220—1998
公共场所卫生检验方法
第4部分：公共用品用具微生物
Examination methods for public places-Part 4:Microorganism on a surface of public articles2013-12-31发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
2014-12-01实施
术语和定义
3细菌总数平血计数法
4大肠菌群多管发酵法
5金黄色葡萄球菌平血鉴定法
真菌总数平血计数法
溶血性链球菌培养法
附录A（规范性附录）
公共场所公共用品用具微生物采样方法GB/T18204.4——2013
GB/T18204《公共场所卫生检验方法》分为六个部分：第1部分：物理因素；
-第2部分：化学污染物；
一第3部分：空气微生物；
第4部分：公共用品用具微生物：第5部分：集中空调通风系统；
第6部分：卫生监测技术规范。
本部分为GB/T18204的第4部分。本部分按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。GB/T18204.4—2013
本部分代替GB/T18204.2-2000《公共场所茶具微生物检验方法细菌总数测定》、GB/T18204.32000《公共场所茶具微生物检验方法大肠菌群测定》，GB/T18204.4—2000《公共场所毛巾、床上卧具微生物检验方法细菌总数测定》、GB/T18204.5—2000《公共场所毛巾、床上卧具微生物检验方法大肠菌群测定》、GB/T18204.6—2000《理发用具微生物检验方法大肠菌群测定》，GB/T18204.7-2000《理发用具微生物检验方法金黄色葡萄球菌测定》、GB/T18204.8-—2000《公共场所拖鞋微生物检验方法霉菌和酵母菌测定》。代替GB/T18204.11—2000《公共场所浴盆、脸（脚）盆微生物检验方法细菌总数测定》、GB/T18204.12--2000《公共场所浴盆、脸（脚）盆微生物检验方法大肠菌群测定》。部分代替GB/T17220—1998《公共场所卫生监测技术规范》中的公共用品用具采样要求。本部分与GB/T18204.2～18204.82000、GB/T18204.11~18204.12--2000和GB/T172201998相比，主要变化如下：
-对菌落计数公式进行了修改；
增加了溶血性链球菌检验方法。本部分由中华人民共和国卫生部提出并归口。本部分由中华人民共和国卫生部负责解释。本部分负责起草单位：江苏省疾病预防控制中心。本部分参加起草单位：南京市疾病预防控制中心。本部分主要起草人：陈连生、沈登、符晓梅、甄世祺、陈晓东、张秀珍、石利民。自本部分实施之日起，GB/T18204.2~18204.8—2000，GB/T18204.11～18204.12—2000全部内容和GB/T17220—1998中相应内容同时废止。GB/T18204.2~18204.8—2000、GB/T18204.11~18204.12—2000的历次版本发布情况为：GB/T18204.2---2000;
GB/T18204.3;
GB/T18204.4;
GB/T18204.5;
-GB/T18204.6;
-GB/T18204.7;
-GB/T18204.8
-GB/T18204.11—-2000;
-GB/T18204.122000。
GB/T17220—1998的历次版本发布情况为：GB/T17220—1998。
1范围
公共场所卫生检验方法
第4部分：公共用品用具微生物
GB/T18204.4-—2013
GB/T18204的本部分规定了公共场所公共用品用具细菌总数、真菌总数、大肠菌群、金黄色葡荐球菌和溶血性链球菌的采样与测定方法。本部分适用于公共场所内公共用品用具细菌总数、真菌总数、大肠菌群、金黄葡萄球菌以及溶血性链球菌的测定，其他场所可参照执行。2术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。2.1
细菌总数total bacterial count公共用品用具经过采样处理，在营养琼脂培养基上经35℃～37℃、48h培养所生长发育的嗜中温性需氧和兼性庆厌氧菌落的总数。2.2
大肠菌群coliforms
在37℃、24h培养能发酵乳糖、产酸、产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。2.3
金黄色葡萄球菌staphylococcusaureus在BairdParker培养基或血平板培养基上生长良好，分解甘露醇产酸，血浆凝固酶阳性的革兰氏阳性葡萄状球菌。
真菌总数total fungicount
在孟加拉红或沙氏琼脂培养基上经25℃～28℃、3d～7d培养所形成菌落的总数。2.5
streptococcus hemolyticus
溶血性链球菌
属于链球菌属，为革兰氏阳性菌，分解葡萄糖，产酸不产气，血平板上产生溶血圈。3细菌总数平血计数法
3.1培养基与试剂
3.1.1生理盐水成分：
氯化钠
蒸馏水
1000mL
制法：称取8.5g氯化钠溶于1000mL蒸馅水中，分装到试管内，每管10mL，121℃高压灭菌15min。
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营养琼脂成分：
蛋白陈
牛肉膏
氯化钠
蒸馏水
10g~20g
1000ml
制法：将上述成分混合后，加热溶解，调整pH为7.1~7.6，分装于玻璃容器内，经103.43kPa（121℃，151b）灭菌20min，储存于冷暗处备用。3.2
仪器和设备
高压蒸汽灭菌器。
干热灭菌箱。
恒温培养箱：36℃士1℃。
冰箱。
电炉或微波炉。
天平：感量0.1g。
涡旋混合器。
无菌试管、平皿（直径9cm）、刻度吸管等。灭菌棉拭子。此内容来自标准下载网
灭菌剪刀。
pH计或精密pH试纸。
放大镜或(和)菌落计数器。
3.3检验步骤
3.3.1采样方法见附录A。
3.3.2样品的稀释：将放有采样后棉拭子的试管充分振摇，此液为1：10的样品匀液。用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1：10样品勾液1mL，沿管壁缓慢注于盛有9mL生理盐水稀释液（3.1.1）的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成1：100的样品勾液。按同法制备10倍系列稀释样品匀液，每递增稀释1次，换用1次1mL无菌吸管或吸头。
3.3.3样品的接种：根据对样品污染状况的估计，选择1个～2个适宜稀释度的样品匀液，在进行10倍递增稀释时，每个稀释度分别吸取1mL样品勾液于2个无菌平血内。同时分别取1mL稀释液加入两个无菌平血作空白对照。
3.3.4样品的培养：及时将15mL~20mL冷却至45℃~50℃的平板计数琼脂培养基（可放置于46℃士1℃恒温水浴箱中保温）倾注平Ⅲ，并转动平皿使其混合均勾。琼脂凝固后，将平板翻转，36℃±1℃培养48h±2h。
3.4菌落计数
3.4.1可用肉眼观察，必要时用放大镜或菌落计数器，记录稀释倍数和相应的菌落数量（CFU)。3.4.2选取菌落数在30CFU～300CFU之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于30CFU的平板记录具体菌落数，大于300CFU的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。
3.4.3其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释2
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度的菌落数；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均勾，即可计算半个平板后乘以2，代表一个平板菌落数。
3.4.4平板内如有链状菌落生长时（菌落之间无明显界限），应将每条链（不同来源)作为一个菌落计。3.5不同稀释度菌落计数计算规则3.5.1若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板菌落数的平均值，再将均值乘以相应稀释倍数，作为每毫开中菌落总数结果。3.5.2若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，则总菌落数按式（1)计算，示例见表1。EC
(ni+0.1nz)d
式中：
定面积的菌落总数，CFU/cm；
平板（含适宜范围菌落数的平板）菌落数之和，单位为CFU；EC
适宜范国菌落数的第一稀释度（低）平板个数；一适宜范围菌落数的第二稀释度（高）平板个数稀释因子（第一稀释度）。
表1两个连续稀释度的平板菌落数稀释度
菌落数
1:100(第一稀释度）
232,244
...(1)
1:1000（第二稀释度）
232+244+33+35
2-24727
[2+0.1×2]×10-2-2.2×10-2
上述数据经“四舍五入”后，表示为25000或2.5×10*。3.5.3若所有稀释度的平板上菌落数均大于300CFU，对稀释度最高的平板进行计数，其他平板可记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。3.5.4若所有稀释度的平板菌落数均小于30CFU,应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。3.5.5若所有稀释度（包括液体样品原液）平板均无菌落生长，以小于1乘以最低稀释倍数计算，3.5.6若所有稀释度的平板菌落数均不在30CFU～300CFU之间，其中一部分大于300CFU或小于30CFU时，则以最接近30CFU或300CFU的平均菌落数乘以稀释倍数计算。3.6结果报告
公共用品用具细菌总数的测定结果按式（2)得出。A
式中：
A细菌总数测定结果；
N平板平均菌落数，单位为CFU；6稀释倍数;
根据采样面积、标准限值单位得出的系数。（2)
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4大肠菌群多管发酵法
4.1培养基和试剂
4.1.1乳糖胆盐发酵培养液
成分：
蛋白陈
猪胆盐（或牛、羊胆盐）
溴甲酚紫水溶液（质量浓度=0.04%）蒸馏水
1000mL
制法：将蛋白陈、胆盐及乳糖溶于蒸馏水中，调pH至7.4，加溴甲酚紫溶液，混匀，分装到带有倒管的试管中，每管10mL。经68.96kPa(115℃，10Ib）高压灭菌20min。注：双料乳糖胆盐发酵管除蒸馏水外,其他成分加倍。4.1.2伊红美蓝琼脂
成分：
蛋白陈
磷酸氢二钾
伊红水溶液（质量浓度=2%）
美蓝水溶液（质量浓度=0.5%）
蒸馏水
1000mL
制法：将蛋白陈、磷酸盐和琼脂溶解于蒸馏水中，调整pH至7.2分装到烧瓶内。经68.96kPa（115℃，101b）高压灭菌20min，临用时加入乳糖并加热熔化琼脂，冷至50℃~55℃，加入伊红和美蓝溶液，摇匀，倾注平。
4.1.3乳糖发酵管
成分：
蛋白陈
溴甲酚紫水溶液（质量浓度一0.04%）蒸馏水
1000mL
制法：将蛋白陈及乳糖溶于水中，调pH至7.4，加入指示剂，分装到带有倒管的试管中，每管3mL，经68.96kPa(115℃，101b）高压灭菌20min。4.1.4革兰氏染色液
结晶紫染色液
成分：
结晶紫
乙醇（95%，体积分数）
草酸铵水溶液（质量浓度=1%）
制法：将结晶紫溶于乙醇中，然后与草酸铵溶液混合4.1.4.2革兰氏碘液
成分：
碘化钾
蒸馏水
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制法：将碘与碘化钾先进行混合，加入蒸馅水少许，充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馅水。4.1.4.3脱色剂
乙醇（95%，体积分数）。
4.1.4.4沙黄复染液
成分：
乙醇（95%，体积分数）
蒸馏水
制法：将沙黄溶解于乙醇中，待完全溶解后加人蒸馏水。4.1.4.5染色法
将培养18h～24h的培养物涂片。将涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染色液，染1min，水洗。滴加革兰氏碘液，作用1min，水洗。滴加乙醇脱剂，摇动玻片，直至无紫色脱落为止，约30s，水洗。滴加复染液，复染1min，水洗，待干，镜检。4.2
仪器和设备
4.2.1高压蒸汽灭菌器。
干热灭菌箱。
培养箱：36℃±1℃。
4.2.4冰箱。
4.2.5电炉或微波炉。
4.2.6天平。
无菌试管、平皿（直径9cm）、刻度吸管等。灭菌棉拭子。
灭菌剪刀。
pH计或精密pH试纸。
显微镜。
涡旋混合器。
4.3检验步骤
4.3.1采样方法见附录A。
GB/T18204.4—2013
4.3.2乳糖胆盐发酵试验：将检样倒入双料乳糖胆盐发酵培养液中。置36℃土1℃培养箱内培养24h士2h，观察是否产酸、产气，如不产酸、不产气则为大肠菌群阴性。若有变黄和气体产生，则按下列步骤进行。
4.3.3分离培养：自产酸、产气发酵管中取接种环培养液，转种伊红美蓝琼脂平板上，置36℃土1℃培养箱培养18h～24h，然后取出，观察菌落形态，并做革兰氏染色和证实性试验。深紫黑色、具有金属光泽的菌落；紫黑色、不带或略带金属光泽的菌落；淡紫红色、中心较深的菌落。
4.3.4证实性试验：在上述平板上，挑取可疑大肠菌群菌落1个～2个进行染色镜检；同时接种乳糖发酵管，置36℃士1℃培养24h士2h。4.4结果报告
凡乳糖发酵管最终产酸、产气，革兰氏染色为阴性的无芽孢杆菌，即可报告检出大肠菌群。5金黄色葡萄球菌平血鉴定法
5.1培养基和试剂
5.1.1胰酪陈大豆肉汤
成分：
胰酪陈(或胰蛋白陈）
植物蛋白陈（或大豆蛋白陈）
氯化钠
磷酸氢二钾
葡萄糖
蒸馏水
1000mL
制法：将上述成分混合后，加热溶解，调pH为7.2～7.3，分装，121℃、20min高压灭菌。2氯化钠肉汤（75g/L）
成分：
蛋白陈
牛肉膏
氮化钠
蒸馏水
1000mL
制法：将上述成分加热溶解，调pH为7.4，分装，121℃、20min高压灭菌。5.1.3BairdParker平板
成分：
胰蛋白陈
牛肉膏
酵母浸膏
丙酮酸钠
甘氨酸
氧化锂（LiCl·6H,O)
蒸馏水
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增菌剂的配制：卵黄盐水（30%，体积分数）50mL与除菌过滤的亚碲酸钾溶液（质量浓度=1%）10mL混合，保存于冰箱内。
制法：将各成分加到蒸馏水中，加热煮沸完全溶解，冷至25℃校正pH至7.0土0.2。分每瓶95mL，121℃高压灭菌15min，临用时加热熔化琼脂，每95mL加入预热至50℃的卵黄亚酸钾增菌5mL，摇勾后倾注平板。培养基应是致密不透明的。使用前在冰箱储存，不得超过48h。5.1.4血琼脂培养基
成分：
营养琼脂
脱纤维羊血(或兔血)
制法：将营养琼脂加热溶化，待冷至50℃左右以无菌方法加人脱纤维羊血，摇匀，制成平板，置冰箱内备用。
5.1.5革兰氏染色液
见4.1.4。
5.2仪器和设备
显微镜。
5.2.2恒温培养箱：36℃±1℃。5.2.3离心机。
5.2.4天平。
高压灭菌锅。
5.2.6热灭菌箱。
无菌试管、平血（直径9cm）、刻度吸管等。pH计或精密pH试纸。
载玻片。
酒精灯。
电炉或微波炉。
5.3操作步骤
5.3.1采样方法见附录A。
5.3.2将1mL样品放人9mL.氯化钠肉汤（5.1.2)或胰酪陈大豆肉汤（5.1.1)培养基中，36℃士1℃培养24h。
5.3.3从培养液中取1接种环～2接种环，划线接种在BairdParker平板（5.1.3）或用血琼脂培养基（5.1.4），于36℃士1℃培养24h。在BairdParker平板培养基上菌落为圆形、光滑、凸起湿润、颜色呈黑灰色、边缘整齐、周围混浊、外层有一透明带；在血平板上菌落呈圆形、金黄色、凸起、表面光滑、周围有溶血圈。
5.3.4挑取典型菌落作涂片染色镜检，为革兰氏阳性，成葡萄状排列。5.3.5血浆凝固酶试验：吸取1：4新鲜血浆0.5mL放人灭菌小试管中，再加人待检菌24h肉汤培养物0.5mL。混匀，放36℃土1℃温箱或水浴中，每30min观察1次，24h之内如呈现凝块即为阳性。7
GB/T18204.4—2013
同时以已知血浆凝固酶阳性和阴性菌株肉汤培养物及肉汤培养基各0.5mL，分别加入灭菌小试管内与1：4血浆0.5mL混匀，作为对照。5.4结果报告
凡在上述选择平板上有可疑菌落生长，经染色镜检，证明为革兰氏阳性葡萄球菌，血浆凝固酶试验阳性，可报告检出金黄色葡萄球菌。6真菌总数平血计数法
6.1培养基与试剂
6.1.1生理盐水
见3.1.1。
孟加拉红培养基
成分：
蛋白陈
葡萄糖
磷酸二氢钾
硫酸镁（MgSO，·7H20)
氮霉素
蒸馏水
孟加拉红水溶液（质量浓度=1：3000）5g
1000ml
制法：将蛋白陈、葡萄糖、磷酸二氢钾、硫酸镁和琼脂溶于蒸馏水中，再加入孟加拉红溶液，分装后121℃高压灭菌20min，待冷至55℃左右加人氯素。6.1.3沙氏琼脂培养基
成分：
蛋白陈
葡葡糖
氯霉素
蒸馏水
1000mL
制法：将蛋白陈、葡萄糖和琼脂溶于蒸馏水中，分装后121℃高压灭菌15min，待冷至55℃左右加入氯霖素。
仪器和设备
恒温箱：25℃~28℃。
6.2.2天平。
6.2.3冰箱。
高压蒸汽灭菌器。
电炉或微波炉。
5无菌试管、平血（直径9cm）、刻度吸管等。6.2.6
6.2.7pH计或精密pH试纸。
6.2.8放大镜或（和)菌落计数器。6.3检验步骤
6.3.1采样方法见附录A。
GB/T18204.4-—2013
6.3.2样品的稀释：将盛有棉拭子的盐水管在手心用力振荡80次，再用带橡皮乳头的1mL灭菌吸管反复吹吸50次，使真菌孢子充分散开，制成1：10稀释液。用灭菌吸管吸取1：10稀释液2mL，分别注人到2个灭菌平皿内，每皿1mL。另取1mL注人9mL灭菌盐水管中，换1支1mL灭菌吸管吹吸5次，此液为1：100稀释液。按上述操作顺序作10倍递增稀释液，每稀释一次，换1支1mL灭菌吸管，根据样品的污染情况，选择3个合适的稀释度。6.3.3样品的培养：将溶化并冷却至45℃左右的培养基注人灭菌的平Ⅲ中，待琼脂凝固后，倒置于25℃～28℃温箱中，3d后开始观察，共培养观察一周。6.4菌落计数
6.4.1通常选择菌落数在5CFU～50CFU之间的平皿进行计数，同稀释度的两个平血的菌落平均数乘以稀释倍数，即为每毫升检样中所含菌落数。6.4.2若两个稀释度的菌落数皆在规定范围之间或3个稀释度皆不在此范围时，应参照3.5计数。6.5结果报告
公共用品用具真菌总数的测定结果按式（3)得出。ANxb
（3）
式中：
A——真菌总数测定结果；
平板平均菌落数，单位为CFU
6稀释倍数；
表根据采样面积、标准限值单位得出的系数。7溶血性链球菌培养法
7.1培养基和试剂
7.1.1葡萄糖肉浸液肉汤
成分：
绞碎牛肉
氯化钠
蛋白陈
磷酸氢二钾
蒸馏水
1000ml
制法：将绞碎之去筋膜无油脂牛肉500g加蒸馏水1000mL，混合后放冰箱过夜，除去液面之浮油，隔水煮沸30min，使肉渣完全凝结成块，用绒布过滤，并挤压收集全部滤液，加水补充原量。加人蛋白陈、氯化钠和磷酸盐，溶解后调整pH7.4~7.6煮沸并过滤，加入1%的葡萄糖，121℃高压灭菌15min。9
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