GH/T 1087-2013
基本信息
标准号： GH/T 1087-2013
中文名称：蜂胶真实性鉴别方法 高效液相色谱指纹图谱法
标准类别：其他行业标准
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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标准分类号
关联标准
出版信息
相关单位信息
标准简介
GH/T 1087-2013 蜂胶真实性鉴别方法 高效液相色谱指纹图谱法
GH/T1087-2013
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标准内容
ICS65.140
备案号：417812013
中华人民共和国供销合作行业标准GH/T1087-—2013
蜂胶真实性鉴别方法
高效液相色谱指纹图谱法
Method for identification of authenticity of propolis-High performance liquid chromatographic fingerprint method2013-10-25发布
中华全国供销合作总社
2014-01-01实施
本标准按照GB/T1.12009给出的规则起草本标准用专利ZL200510060230.8本标准由杭州蜂之语蜂业股份有限公司提出本标准由中华全国供销合作总社归口。本标准起草单位：杭州蜂之语蜂业股份有限公司、浙江省食品药品检验研究院，本标准主要起草人：周萍、章征天、陈建清、陶巧风、罗金文、李樱红。GH/T1087—2013
GH/T1087—2013
本文件的发布机构提请注意，声明符合本文件时，涉及到本文件相关的专利（2L200510060230.8）的使用。
本文件的发布机构对于该专利的真实性、有效性和范围无任何立场。该专利持有人已向本文件的发布机构保证，他愿意同任何申请人在合理且无歧视的条款和条件下，就专利授权许可进行谈判。该专利持有人的声明已在本文件的发布机构备案。相关信息可以通过以下联系方式获得：
专利持有人：杭州蜂之语蜂业股份有限公司。地址：浙江省杭州市桐庐县乔林路898号请注意除上述专利外，本文件的某些内容仍可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。
1范围
蜂胶真实性鉴别方法
高效液相色谱指纹图谱法
本标准规定了高效液相色谱指纹图谱鉴别蜂胶真实性的方法。GH/T1087-2013
本标准适用于杨树型蜂胶原料、以食用酒精为溶剂提取的杨树型蜂胶提取物及其制品中蜂胶真实性的鉴别。
本标准不适用于以含有黄酮类化合物的原料（蜂胶除外）配伍的蜂胶复方制剂中蜂胶真实性的鉴别。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仪注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T24283蜂胶
保健食品检验与评价技术规范（2003版）3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。3.1
chromatographicfingerprint
指纹图谱
本标准特指蜂胶、杨树胶等经过适当处理后，采用高效液相色谱法分析，得到的能够反映其化学特征的色谱图。
相似度similarity
表征两张指纹图谱相似程度的参数3.3
thecharacteristic chromatographic peaks特征色谱峰
色谱图中具有一定特征性的色谱峰。3.4
交poplartypepropolis
杨树型蜂胶
杨属（populus）为主要植物来源的蜂胶。3.5
poplartreegum
杨树胶
用杨树芽、杨树叶等杨树组织经人.工制成的胶状物质。GH/T1087—2013
4原理
样品经过甲醇提取，用0.4%磷酸酸化，以高效液相色谱在360nm波长下测定样液的指纹图谱，根据样品与杨树型蜂胶、杨树胶的对照标准图谱的相似程度进行比较，使用中药指纹图谱相似度软件计算样品的相似度，根据相似度判断蜂胶的真实性5试剂
磷酸：分析纯。
5.2甲醇：色谱纯。
5.30.4%c体积分数）磷酸：吸取4mL磷酸（5.1)到加有900mL水的容量瓶中，用水定容至1000mL。水：GB/T6682规定的实验用一级水。5.4
标准品如下
咖啡酸：标准品，CASNO.331-39-5，纯度≥98%。a)
芦丁：标准品，CASNO.153-18-4，纯度≥92%。c
\\皮索：标准品，CASNO.117-39-5，纯度≥98%。杨梅酮：标准品，CASNO.529-44-2纯度≥98%。芹菜素：标准品，CASNO.520-36-5，纯度≥98%。菲醇：标准品，CASNO.520-18-3，纯度≥97%。松属素：标准品，CASNO.480-39-7，纯度≥98%。g
柯因：标准品，CASNO.480-40-0，纯度≥98%。6参照物溶液：准确称取咖啡酸、芦丁、榭皮素、杨梅酮、芹菜素、茨菲醇、松属素、柯因标准品各10.0mg5.6
（按标准物质证书上标示的浓度折算后得到），置于10mL容量瓶中，用甲醇落解并稀释至刻度，摇勾，精密吸取1.0mL，置20mL容量瓶中，用流动相稀释至刻度，播勾.此标准溶液每1mL含0.05mg咖啡酸、芦丁、皮素、杨梅酮、芹菜素、茨菲醇、松属素、柯因。杨树型蜂胶对照标准图谱制备方法见附录^。5.7
杨树胶对照标准图谱制备方法见附录A。仪器和设备
电子天平：感量0.0001g。
高效液相色谱仪配紫外检测器。6.3
超声波仪。
6.4旋转蒸发仪。bzxz.net
真空于燥机。
中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004年版）。7
分析步骤
7.1样品前处理
按照《保健食品检验与评价技术规范》（2003版）中保健食品中总黄酮的测定方法预检测样品中的总黄酮含量，称取适量样品（精确到0.1mg）（使样品中含有10mg总黄酮），置于50mL容量瓶中，加人GH/T1087—2013
9mL甲醇（5.2），充分溶解样品，必要时可以超声波助溶，加人6mL0.4%磷酸（5.3），播勾，用流动相（7.2.1）稀释至刻度，据匀.用滤纸过滤，弃去5mL初滤液，取适量滤液经0.45μm有机系滤膜过滤后作为待测溶液。另取蜂胶、杨树胶对照样品同上法处理，作为蜂胶对照样品溶液和杨树胶对照样品溶液。7.2测定
7.2.1色谱条件
测定色谱条件如下：
色谱柱：VcnusilMPC250mm×4.6mm×5μm或相当者；流动相：甲醇十0.4%磷酸（体积分数）=60十40：柱温：35℃；
进样量：5L；
流速：1mL/min；
检测波长：360nm。
7.2.2指纹图谱测定
分别精密吸取蜂胶对照样品溶液、杨树胶对照样品溶液、参照物溶液与待测溶液，按7.2.1色谱条件检测，记录0min～60min的色谱图。对柯因色谱峰前的13个特征色谱峰进行积分，用中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版建立蜂胶、杨树胶对照模板，用中药色谱指纹图谱相似度评价系统B版计算各样品的相似度。
7.3方法精密度
在重复性条件下对同样品连续进行两次测定，相对偏差≤0.6%。8定性判定
8.1在相同试验条件下，将样品指纹图谱与同时测定的8种参照物图谱及蜂胶、杨树胶对照指纹图谱进行比较，典型的对照指纹图谱及15个特征色谱峰的设定见附录B。8.2蜂胶定性鉴别：供试样品指纹图谱应呈现与参照物色谱图中咖啡酸、非醇、松属素、柯因色谱峰保留时间相同的色谱峰，按中药色谱指纹图谱相似度评价系统计算柯因色谱峰前的13个主要特征色谱峰，样品指纹图谱与蜂胶对照指纹图谱的相似度不小于0.90，与杨树胶对照指纹图谱的相似度不大于0.93，可判定为蜂胶”。
8.3：杨树胶定性鉴别：
a）供试样品指纹图谱应呈现与参照物色谱图中菲醇、松属素、柯因色谱峰保留时间相同的色谱峰，不呈现咖啡酸色谱峰，按中药色谱指纹图谱相似度评价系统计算柯因色谱峰前的13个主要特征色谱峰，样品指纹图谱与杨树胶对照指纹图谱的相似度不小于0.90，与蜂胶对照指纹图谱的相似度小于0.90，可判定为“杨树胶”。b）供试样品指纹图谱应呈现与参照物色谱图中获菲醇、松属素、柯因色谱蜂保留时间相同的色谱峰，按中药色谱指纹图谱相似度评价系统计算柯因色谱峰前的13个主要特征色谱峰，样品指纹图谱与杨树胶对照指纹图谱及蜂胶对照指纹图谱的相似度均小于0.90.不呈现咖啡酸色谱峰，且11号、13号峰的峰面积与12号峰的峰面积之比均小于0.20，可判定为\杨树胶”。8.4蜂胶中掺入杨树胶定性鉴别：供试样品指纹图谱含有与蜂胶对照指纹图谱相应的15个主要待征色谱峰，按中药色谱指纹图谱相似度评价系统计算柯因色谱峰前的13个主要特征色谱峰，样品指纹图3
GH/T1087—2013
谱与杨树胶对照指纹图谱的相似度不小于0.93，可判定为“混有杨树胶的蜂胶”5蜂胶中掺人黄酮类化合物定性鉴别：供试样品指纹图谱含有与蜂胶对照指纹图谱相应的15个主8.5
要特征色谱峰，但某个特征峰峰高异常，峰面积是蜂胶对照指纹图谱的2倍以上。可判定为“掺有该科黄酮类化合物”。
8.6非蜂胶物质的定性鉴别：供试样品指纹图谱与蜂胶对照指纹图谱的15个主要特征色谱峰相比，不呈现6个以上蜂胶的主要特征色谱峰。可判定为“非蜂胶物质”。9
结果表迷
判定为“蜂胶”的用“真”表示，判定为“混有杨树胶的蜂胶”或“掺有黄酮类化合物”的用“掺假”表示，判定为“杨树胶”“非蜂胶物质”的用“假”表示。附录A
（规范性附录）
蜂胶与杨树胶对照标准图谱的制备方法A.1蜂胶对照标准图谱的制备方法A.1.1蜂胶对照样品制备方法
GH/T1087—2013
取按GB/T24283感官检验合格的蜂胶粗品10g，经过粉碎机粉碎，置于烧杯中，加人95头食用酒精40g，常温下超声提取30min，过滤，滤液置于150mL茄形瓶中，在旋转蒸发器上45℃减压浓缩至粘稠，转移至蒸发阻中，70℃～90℃水浴继续蒸去乙醇，至无乙醇味，趁热倒人不锈钢盘中，70℃，-0.096MPa～0.1MPa真空干燥4h，制得蜂胶对照样品。A.1.2要求
A.1.2.1乙醇提取物含量
取按A.1.1制得的蜂胶对照样品按GB/T24283中乙醇提取物含量测定方法检测，乙醇提取物含量不得低于95%。
A.1.2.2蜂胶对照标准图谱的构建取按A.1.1制得的蜂胶对照样品，按本标准方法测定HPLC指纹图谱，根据8种参照物图谱（见图B.3）对柯因色谱峰前的特征峰进行定位、应含有与蜂胶对照指纹图谱模板（见图B.1)一致的特征色谱峰。
A.2杨树胶对照标准图谱的制备方法A.2.1
杨树胶对照样品制备方法
取市售杨树胶粗品10g·经过粉碎机粉碎，置于烧杯中，加人95%食用酒精40g，常温下超声提取30min，过滤，滤液置于150mL茄形瓶中，在旋转蒸发器上45减压浓缩至黏稠，转移至蒸发Ⅲ中，70℃～90℃水浴继续蒸去乙醇，至无乙醇味，趁热倒人不锈钢盘中，70℃，-0.096MPa～0.1MPa真空干燥4h，制得杨树胶对照样品。A.2.2要求
乙醇提取物含量
取按A.2.1制得的杨树胶对照样品按GB/T24283中乙醇提取物含量测定方法检测，乙醇提取物含量不得低于95%。
对照标准图谱的构建
取按Λ.2.1制得的杨树胶对照样品，按本标准方法测定HPLC指纹图谱，根据8种参照物图谱（见图B.3)对柯因色谱峰前的特征峰进行定位，应含有与杨树胶对照指纹图谱模板（见图B.2）一致的特征色谱峰。
GH/T1087—2013
（规范性附录）
典型对照图谱
蜂胶对照指纹图谱模板
杨树胶对照指纹图谱模板
说明：
咖啡酸：
芦了：
杨梅酮，
致菲醇：
芹菜素：
松属素：
柯因。
GH/T1087—2013
注：由于色谱柱批次、流动相配制、仪器性能、环境条件等变化，各色谱峰的保留时间可能会有变化。图B.3
八种参照物图谱
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备案号：417812013
中华人民共和国供销合作行业标准GH/T1087-—2013
蜂胶真实性鉴别方法
高效液相色谱指纹图谱法
Method for identification of authenticity of propolis-High performance liquid chromatographic fingerprint method2013-10-25发布
中华全国供销合作总社
2014-01-01实施
本标准按照GB/T1.12009给出的规则起草本标准用专利ZL200510060230.8本标准由杭州蜂之语蜂业股份有限公司提出本标准由中华全国供销合作总社归口。本标准起草单位：杭州蜂之语蜂业股份有限公司、浙江省食品药品检验研究院，本标准主要起草人：周萍、章征天、陈建清、陶巧风、罗金文、李樱红。GH/T1087—2013
GH/T1087—2013
本文件的发布机构提请注意，声明符合本文件时，涉及到本文件相关的专利（2L200510060230.8）的使用。
本文件的发布机构对于该专利的真实性、有效性和范围无任何立场。该专利持有人已向本文件的发布机构保证，他愿意同任何申请人在合理且无歧视的条款和条件下，就专利授权许可进行谈判。该专利持有人的声明已在本文件的发布机构备案。相关信息可以通过以下联系方式获得：
专利持有人：杭州蜂之语蜂业股份有限公司。地址：浙江省杭州市桐庐县乔林路898号请注意除上述专利外，本文件的某些内容仍可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。
1范围
蜂胶真实性鉴别方法
高效液相色谱指纹图谱法
本标准规定了高效液相色谱指纹图谱鉴别蜂胶真实性的方法。GH/T1087-2013
本标准适用于杨树型蜂胶原料、以食用酒精为溶剂提取的杨树型蜂胶提取物及其制品中蜂胶真实性的鉴别。
本标准不适用于以含有黄酮类化合物的原料（蜂胶除外）配伍的蜂胶复方制剂中蜂胶真实性的鉴别。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仪注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T24283蜂胶
保健食品检验与评价技术规范（2003版）3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。3.1
chromatographicfingerprint
指纹图谱
本标准特指蜂胶、杨树胶等经过适当处理后，采用高效液相色谱法分析，得到的能够反映其化学特征的色谱图。
相似度similarity
表征两张指纹图谱相似程度的参数3.3
thecharacteristic chromatographic peaks特征色谱峰
色谱图中具有一定特征性的色谱峰。3.4
交poplartypepropolis
杨树型蜂胶
杨属（populus）为主要植物来源的蜂胶。3.5
poplartreegum
杨树胶
用杨树芽、杨树叶等杨树组织经人.工制成的胶状物质。GH/T1087—2013
4原理
样品经过甲醇提取，用0.4%磷酸酸化，以高效液相色谱在360nm波长下测定样液的指纹图谱，根据样品与杨树型蜂胶、杨树胶的对照标准图谱的相似程度进行比较，使用中药指纹图谱相似度软件计算样品的相似度，根据相似度判断蜂胶的真实性5试剂
磷酸：分析纯。
5.2甲醇：色谱纯。
5.30.4%c体积分数）磷酸：吸取4mL磷酸（5.1)到加有900mL水的容量瓶中，用水定容至1000mL。水：GB/T6682规定的实验用一级水。5.4
标准品如下
咖啡酸：标准品，CASNO.331-39-5，纯度≥98%。a)
芦丁：标准品，CASNO.153-18-4，纯度≥92%。c
\\皮索：标准品，CASNO.117-39-5，纯度≥98%。杨梅酮：标准品，CASNO.529-44-2纯度≥98%。芹菜素：标准品，CASNO.520-36-5，纯度≥98%。菲醇：标准品，CASNO.520-18-3，纯度≥97%。松属素：标准品，CASNO.480-39-7，纯度≥98%。g
柯因：标准品，CASNO.480-40-0，纯度≥98%。6参照物溶液：准确称取咖啡酸、芦丁、榭皮素、杨梅酮、芹菜素、茨菲醇、松属素、柯因标准品各10.0mg5.6
（按标准物质证书上标示的浓度折算后得到），置于10mL容量瓶中，用甲醇落解并稀释至刻度，摇勾，精密吸取1.0mL，置20mL容量瓶中，用流动相稀释至刻度，播勾.此标准溶液每1mL含0.05mg咖啡酸、芦丁、皮素、杨梅酮、芹菜素、茨菲醇、松属素、柯因。杨树型蜂胶对照标准图谱制备方法见附录^。5.7
杨树胶对照标准图谱制备方法见附录A。仪器和设备
电子天平：感量0.0001g。
高效液相色谱仪配紫外检测器。6.3
超声波仪。
6.4旋转蒸发仪。bzxz.net
真空于燥机。
中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004年版）。7
分析步骤
7.1样品前处理
按照《保健食品检验与评价技术规范》（2003版）中保健食品中总黄酮的测定方法预检测样品中的总黄酮含量，称取适量样品（精确到0.1mg）（使样品中含有10mg总黄酮），置于50mL容量瓶中，加人GH/T1087—2013
9mL甲醇（5.2），充分溶解样品，必要时可以超声波助溶，加人6mL0.4%磷酸（5.3），播勾，用流动相（7.2.1）稀释至刻度，据匀.用滤纸过滤，弃去5mL初滤液，取适量滤液经0.45μm有机系滤膜过滤后作为待测溶液。另取蜂胶、杨树胶对照样品同上法处理，作为蜂胶对照样品溶液和杨树胶对照样品溶液。7.2测定
7.2.1色谱条件
测定色谱条件如下：
色谱柱：VcnusilMPC250mm×4.6mm×5μm或相当者；流动相：甲醇十0.4%磷酸（体积分数）=60十40：柱温：35℃；
进样量：5L；
流速：1mL/min；
检测波长：360nm。
7.2.2指纹图谱测定
分别精密吸取蜂胶对照样品溶液、杨树胶对照样品溶液、参照物溶液与待测溶液，按7.2.1色谱条件检测，记录0min～60min的色谱图。对柯因色谱峰前的13个特征色谱峰进行积分，用中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版建立蜂胶、杨树胶对照模板，用中药色谱指纹图谱相似度评价系统B版计算各样品的相似度。
7.3方法精密度
在重复性条件下对同样品连续进行两次测定，相对偏差≤0.6%。8定性判定
8.1在相同试验条件下，将样品指纹图谱与同时测定的8种参照物图谱及蜂胶、杨树胶对照指纹图谱进行比较，典型的对照指纹图谱及15个特征色谱峰的设定见附录B。8.2蜂胶定性鉴别：供试样品指纹图谱应呈现与参照物色谱图中咖啡酸、非醇、松属素、柯因色谱峰保留时间相同的色谱峰，按中药色谱指纹图谱相似度评价系统计算柯因色谱峰前的13个主要特征色谱峰，样品指纹图谱与蜂胶对照指纹图谱的相似度不小于0.90，与杨树胶对照指纹图谱的相似度不大于0.93，可判定为蜂胶”。
8.3：杨树胶定性鉴别：
a）供试样品指纹图谱应呈现与参照物色谱图中菲醇、松属素、柯因色谱峰保留时间相同的色谱峰，不呈现咖啡酸色谱峰，按中药色谱指纹图谱相似度评价系统计算柯因色谱峰前的13个主要特征色谱峰，样品指纹图谱与杨树胶对照指纹图谱的相似度不小于0.90，与蜂胶对照指纹图谱的相似度小于0.90，可判定为“杨树胶”。b）供试样品指纹图谱应呈现与参照物色谱图中获菲醇、松属素、柯因色谱蜂保留时间相同的色谱峰，按中药色谱指纹图谱相似度评价系统计算柯因色谱峰前的13个主要特征色谱峰，样品指纹图谱与杨树胶对照指纹图谱及蜂胶对照指纹图谱的相似度均小于0.90.不呈现咖啡酸色谱峰，且11号、13号峰的峰面积与12号峰的峰面积之比均小于0.20，可判定为\杨树胶”。8.4蜂胶中掺入杨树胶定性鉴别：供试样品指纹图谱含有与蜂胶对照指纹图谱相应的15个主要待征色谱峰，按中药色谱指纹图谱相似度评价系统计算柯因色谱峰前的13个主要特征色谱峰，样品指纹图3
GH/T1087—2013
谱与杨树胶对照指纹图谱的相似度不小于0.93，可判定为“混有杨树胶的蜂胶”5蜂胶中掺人黄酮类化合物定性鉴别：供试样品指纹图谱含有与蜂胶对照指纹图谱相应的15个主8.5
要特征色谱峰，但某个特征峰峰高异常，峰面积是蜂胶对照指纹图谱的2倍以上。可判定为“掺有该科黄酮类化合物”。
8.6非蜂胶物质的定性鉴别：供试样品指纹图谱与蜂胶对照指纹图谱的15个主要特征色谱峰相比，不呈现6个以上蜂胶的主要特征色谱峰。可判定为“非蜂胶物质”。9
结果表迷
判定为“蜂胶”的用“真”表示，判定为“混有杨树胶的蜂胶”或“掺有黄酮类化合物”的用“掺假”表示，判定为“杨树胶”“非蜂胶物质”的用“假”表示。附录A
（规范性附录）
蜂胶与杨树胶对照标准图谱的制备方法A.1蜂胶对照标准图谱的制备方法A.1.1蜂胶对照样品制备方法
GH/T1087—2013
取按GB/T24283感官检验合格的蜂胶粗品10g，经过粉碎机粉碎，置于烧杯中，加人95头食用酒精40g，常温下超声提取30min，过滤，滤液置于150mL茄形瓶中，在旋转蒸发器上45℃减压浓缩至粘稠，转移至蒸发阻中，70℃～90℃水浴继续蒸去乙醇，至无乙醇味，趁热倒人不锈钢盘中，70℃，-0.096MPa～0.1MPa真空干燥4h，制得蜂胶对照样品。A.1.2要求
A.1.2.1乙醇提取物含量
取按A.1.1制得的蜂胶对照样品按GB/T24283中乙醇提取物含量测定方法检测，乙醇提取物含量不得低于95%。
A.1.2.2蜂胶对照标准图谱的构建取按A.1.1制得的蜂胶对照样品，按本标准方法测定HPLC指纹图谱，根据8种参照物图谱（见图B.3）对柯因色谱峰前的特征峰进行定位、应含有与蜂胶对照指纹图谱模板（见图B.1)一致的特征色谱峰。
A.2杨树胶对照标准图谱的制备方法A.2.1
杨树胶对照样品制备方法
取市售杨树胶粗品10g·经过粉碎机粉碎，置于烧杯中，加人95%食用酒精40g，常温下超声提取30min，过滤，滤液置于150mL茄形瓶中，在旋转蒸发器上45减压浓缩至黏稠，转移至蒸发Ⅲ中，70℃～90℃水浴继续蒸去乙醇，至无乙醇味，趁热倒人不锈钢盘中，70℃，-0.096MPa～0.1MPa真空干燥4h，制得杨树胶对照样品。A.2.2要求
乙醇提取物含量
取按A.2.1制得的杨树胶对照样品按GB/T24283中乙醇提取物含量测定方法检测，乙醇提取物含量不得低于95%。
对照标准图谱的构建
取按Λ.2.1制得的杨树胶对照样品，按本标准方法测定HPLC指纹图谱，根据8种参照物图谱（见图B.3)对柯因色谱峰前的特征峰进行定位，应含有与杨树胶对照指纹图谱模板（见图B.2）一致的特征色谱峰。
GH/T1087—2013
（规范性附录）
典型对照图谱
蜂胶对照指纹图谱模板
杨树胶对照指纹图谱模板
说明：
咖啡酸：
芦了：
杨梅酮，
致菲醇：
芹菜素：
松属素：
柯因。
GH/T1087—2013
注：由于色谱柱批次、流动相配制、仪器性能、环境条件等变化，各色谱峰的保留时间可能会有变化。图B.3
八种参照物图谱
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