GB 23748-2016 食品安全国家标准 辐照食品鉴定 筛选法 GB23748-2016 标准压缩包解压密码：www.bzxz.net

中华人民共和国国家标准
GB23748—2016
食品安全国家标准
辐照食品鉴定bZxz.net
2016-12-23发布
筛选法
2017-06-23实施
中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会国家食品药品监督管理总局
GB23748—2016
本标准代替GB/T23748—2009《辐照食品的鉴定DNA彗星试验法
筛选法》、NY/T2214-
2012《辐照食品鉴定光释光法》和SN/T2910.2—2011《出口辐照食品的鉴别方法第2部分：单细胞
凝胶电泳法》。
本标准与GB/T23748—2009相比，主要变化如下：标准名称修改为“食品安全国家标准辐照食品鉴定筛选法”；
一增加了两种筛选方法：光释光法和微生物学筛选法；一增加了DNA彗星试验法的限制性说明I
1范围
食品安全国家标准
辐照食品鉴定
筛选法
GB23748—2016
本标准规定了三种快速筛选食品是否接受过辐照的鉴定方法：光释光法、DNA彗星试验法和微生物学筛选法。
本标准中的光释光法适用于甲壳类、香辛料和调味品类产品的辐照鉴定；DNA彗星试验法适用于动物产品、谷物、坚果、果蔬的辐照鉴定；微生物学筛选法适用于冷冻畜禽肉和水产品等各类生鲜食品的辐照鉴定。
第一法光释光法
2术语和定义
光释光（photostimulatedluminescence，PSL富含硅酸盐类样品俘获的辐射能量经一定波长的光激发后，以光的形式释放出来的现象，2PSL强度（PSLintensity）
样品经光激发后检测到的发光量，以光子计数率表示。2.3筛查PSL(screeningPSL)
样品初次测量的PSL强度。
校正PSL（calibratedPSL）
筛查PSL测量之后，同一样品用已知剂量辐照后测量的PSL强度2.5
阅值（thresholds）
在筛查模式下，用于判定样品辐照与否的PSL强度，包括一个低阈值（T,）和一个高阈值（T，）。2.6阴性PSL(negativePSLresult）PSL测量强度低于低阈值。
可疑PSL（intermediatePSLresult）2.7
PSL测量强度在低阈值和高阈值之间。阳性PSL(positivePSLresult）
PSL测量强度高于高阈值。
空白对照（darkcount）
无光刺激时，对空样品容器获得的光子计数率。2.10阳性对照（lightcount）
GB23748—2016
将参考光源（比如装有1+C的闪烁体或者等效物）置于样品容器中得到的光子计数率。3原理
富含硅酸盐类物质的样品能够储存射线能量。通过一定波长的光再次激发照射，样品中储存的能量可以释放，产生光释放光信号。利用光释放光检测仪测试光信号的强度，比较不同光信号强度的天小，判定样品是否经过辐照。
4仪器和设备
光释光测量系统：包括样品容器、光激发源、脉冲刺激仪和同步光子计数系统，4.1
测量盘：直径5cm。
电离辐射源：对电离辐射源的使用和管理按GB17568和GB/T25306的规定。5分析步骤
注：样品在测量前避光放置。测量时使用一次性测量盘。香辛料和调味品的样品制备
准备双份样品，均匀铺在测量盘底部，分别检测。如果两次检测结果与判定阈值相比不一致，则将样品4等分后重新进行检测：取其中最高的两个检测值作为结果进行判定，依此类推5.2甲壳类动物的样品制备
将带壳或去壳样品放人测量盘中，样品中带有动物肠子时有利于光释光信号的检测。如个体较大，可对样品切割；也可取肠子（不少于6根）放人测量盘中进行测量。5.31
仪器设置
设定辐照食品筛查系统的个体测量参数。检查空白对照和阳性对照
注：应当定期或者当测量出现阳性结果后，对容器进行空样品检测，检查仪器是否受到污染5.4样品测定
5.4.1筛查测量
进行样品检测并记录结果。
5.4.2校正测量
筛查测量后的样品加盖保存，防止样品损失或污染。对这些样品再辐照特定剂量（香辛料和贝类食物辐照1kGy），辐照后室温（甲壳类动物和其他易腐烂样品应冷藏）避光保存12h，进行校正测量。2
6分析结果表述
阐值设定
香料和调味品的阈值设定为：T，=700counts/min，T，=5000counts/min。甲壳类动物的阅值设定为：T=100ocounts/min，T，=4o00counts/min。6.2
结果判断
GB23748—2016
根据与國值的比较，样品测量结果可分为阴性可疑、阳性三种情况，分别进行判定。6.2.1阴性结果
6.2.1.1筛查PSL
筛查PSL为阴性结果时，可判定样品未经辐照。校正PSL
校正PSL和筛查PSL同为阴性时，该样品不能被判定为辐照食品。若要进一步确认样品是否接受过辐照，应采用辐照食品鉴定的其他确证方法校正PSL为阴性，但筛查PSL为阳性时.表明测量系统有错误，应当取新鲜的原始样品重新测量。6.2.2可疑结果
6.2.2.1筛查PSL
筛查PSL为可疑结果时，不能直接判定样品是否接受过辐照6.2.2.2
校正PSL
校正PSL和筛查PSL同为可疑结果时，判定样品接受过辐照。校正PSL为可疑结果，筛查PSL为阴性结果时，表明样品可能是低敏感性未辐照食品。若要进一步确认样品是否接受过辐照，应采用辐照食品鉴定的其他确证方法校正PSL为可疑结果，筛查PSL为高数值阳性结果时，表明测量有误校正PSL为可疑结果，筛查PSL为接近T，的阳性结果时，表明样品可能接受过高于校正剂量的辐照。应当重新测量样品进行判定。6.2.3阳性结果
6.2.3.1筛查PSL
筛查PSL为阳性结果时，可判定样品接受过辐照。6.2.3.2
校正PSL
校正PSL和筛查PSL为同级别的阳性结果时，判定样品接受过辐照、校正PSL为阳性结果，且远高于阴性或可疑结果的筛查PSL时，表明样品可能未经辐照。校正PSL和筛查PSL为阳性结果，但校正PSL小于筛查PSL时（相差1到2个数量级），表明测量有误，需要重新进行测量
7原理
第二法
DNA普星试验法
GB23748—2016
DNA分子经过辐照后会发生断裂。将细胞包埋在琼脂中，用裂解试剂溶解细胞膜，然后在一定的电压下进行电泳。受损的DNA片段在电场中向阳极方向快速移动，形成尾状分布。染色后，DNA受损的细胞就会出现星状电泳图谱，未受辐射的细胞图谱接近圆形或者轻微拖尾8试剂
除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的三级水8.1
二甲基亚砜(DMSO,C,H,OS)。
氯化钠(NaCI)。
氯化钾（KCI）。
磷酸氢二钠（NazHPO，·12HzO）。磷酸二氢钾（KH,PO,）。
乙二胺四乙酸二钠（NazEDTA.CH.4N,ONa·2H2O)。氢氧化钠（NaOH)。
三羟甲基氨基甲烷（Tris.C4HuNO，）硼酸（H,BO）。
+二烷基磺酸钠(SDS，CizH2sO,NaS)。吖啶橙(CHN，·HCl·ZnCl,）。溴化乙锭（CH2BrN）。
三氯乙酸（TCA,C,HCl,Oz）。
硫酸锌（ZnSO）。
甘油(C,HO)。
碳酸钠（NazCO,）。
硝酸铵（NH.NO,)。
硝酸银（AgNO：）。
钨硅酸(H,[Si(W,O1)·xHO)。
甲醛(CH,O)。
冰乙酸(CH,COOH)。
磺化吡啶（C1H2O,N,S)。
琼脂糖。
低熔点琼脂糖。
试剂配制
试验中所用的试剂配制见附录A。4
10仪器和设备
10.1水平电泳槽
10.2电子天平：感量为0.1g。
10.3电加热磁力搅拌器。
10.4微波炉。
10.5微孔滤膜：孔径100μm、200μm、500μm。10.6显微镜载玻片：76mm×26mm，带磨砂边。GB23748—2016
10.7荧光显微镜：100倍～400倍；蓝色激发波长460nm～485nm.用于吖啶橙染色观察；绿色激发波长515nm~560nm，用于磺化吡啶或溴化乙锭染色观察。分析步骤
11.1样品制备
11.1.1动物组织
骨髓样品制备
切开骨头，称取约50mg骨髓置于试管中，加入3mL冰预冷的PBS缓冲液。用玻璃棒搅拌，将细胞悬起，用100μm的微孔滤膜过滤细胞悬液，收集滤液并将滤液置于冰盒上，备用（细胞悬液可置于冰上放置，时间不超过10min；在加人5%～10%的DMSO作为防冻剂后，细胞可置于一20℃保存26h）。11.1.1.2肌肉组织样品制备
用解剖刀将肌肉组织切成薄片（不能有可见脂肪）。称取1g肌肉置于小烧杯中，加人5mL冰预冷的PBS缓冲液。将该烧杯置于冰盒中，玻璃棒搅拌5min，依次用500μm和200μm的微孔滤膜过滤，收集滤液并在冰盒上放置5min，备用。11.1.2植物组织
11.1.2.1原粮、坚果和调味料等食品称取样品0.25g，用研钵碾碎，置于小烧杯中，加人3mL冰预冷的PBS缓冲液。将该烧杯置于冰盒中，用玻璃棒搅拌5min，依次用500μm和200um的微孔滤膜过滤，收集滤液并在冰盒上放置15min~60min，备用。
11.1.2.2草莓等浆果
称取0.25g草莓浆果，用研钵碾碎，置于小烧杯中，加入3mL冰预冷的PBS缓冲液。将该烧杯置于冰盒中，用玻璃棒搅拌5min，依次用500μm和200μm的微孔滤膜过滤，收集滤液并在冰盒上放置15min~60min，备用。
11.1.2.3蔬菜（不包括食用菌）将蔬菜的可食部分用解剖刀切成薄片，取4g，加入5mL冰预冷的PBS缓冲液，用研钵碾碎，置于小烧杯中，加人3mL冰预冷的PBS。将该小烧杯置于冰盒中，玻璃棒搅拌5min，依次用500μm和200um的微孔滤膜过滤，收集滤液并在冰盒上放置15min～60min，备用。5
11.2预涂载玻片
GB23748—2016
涂布前，应将载玻片用甲醇浸泡以除去表面油脂。风干后，滴一滴（约50uL)涂层琼脂糖溶液于载玻片上，立即取另一个载玻片盖在琼脂糖上，使琼脂糖溶液散开，取下上层载玻片，风干30min，待用。11.3包埋凝胶
取100μuL细胞悬液与1mL包埋凝胶溶液混匀，然后取100μL该混合液用微量移液器的吸头轻轻涂布在预涂载玻片上，立即盖上盖玻片使凝胶铺展均匀，注意不可产生气泡。将载玻片置于冰盒上5min，然后用解剖刀尖将盖玻片从琼脂糖上剥离。11.4溶解细胞
将11.3制备的载玻片完全浸人裂解缓冲液中（动物细胞≥5min，植物细胞≥15min），使细胞溶解，溶解过程不要碰触琼脂糖。11.5回湿
将载玻片浸人电泳缓冲液中，时间5min。11.6电泳
将载玻片并排放入水平电泳槽，磨砂边缘朝向阴极。电泳槽中加入电泳缓冲液没过载玻片2mm~4mm。室温下电泳20min，电压2V/cm。关闭电源后，将载玻片放人水中5min，室温下风干1h。11.7染色
11.7.1吖啶橙、磺化吡啶或漠化乙锭染色将载玻片浸人染色液（吖啶橙染色液、磺化吡啶染色液或溴化乙锭染色液）3min~5min，然后浸人水中清洗0.5min～1min，擦干载玻片下多余的水分，荧光显微镜观察。11.7.2硝酸银染色
将载玻片置于混合液A10min，水洗1min，40℃~50℃恒温干燥箱干燥1h或室温风干。然后将载玻片浸人混合液D10min～20min，重复该步骤1次～2次，染色时间5min~10min，直至载玻片呈现棕色。水洗1min，用停止液E浸泡5min停止染色反应，再水洗1min。最后将载玻片室温放置，自然风干。染色后的载玻片不会褪色，可长期保存观察。注：荧光染料易淬灭，染色要迅速；染色液有毒，试验结束后，应对废液进行净化处理再行弃置11.8观察鉴别
11.8.1荧光观察
吖啶橙染色的载玻片应用荧光显微镜（460nm～485nm，蓝光激发）观察，染色DNA发出绿色荧光。
磺化吡啶或溴化乙锭染色的载玻片应用荧光显微镜（515nm～560nm，绿色激发）配合590nm滤光片观察，染色DNA发出红色荧光11.8.2白光观察
硝酸银染色的载玻片可使用普通显微镜观察6
2分析结果的表述
12.1结果表述
GB23748—2016
通过显微镜观察，辐照过的样品几乎没有完整细胞，全部是彗星图像（见图B.1和图B.2）；未受损的细胞不拖尾或者有轻拖尾（见图B.3和图B.4）。12.2判定结果
出现彗星图像时，结果报告为阳性，样品可能经过辐照。未出现彗星图像时，结果报告为阴性，样品未经辐照。3限制性说明
实际上不同样品产生的彗星形状会有明显差异，而且其他处理过程也可能影响DNA形态，这给辐照食品的判定带来困难。故DNA星试验法只能作为辐照食品的筛查办法，最终确定食品是否接受了辐照，需要配合其他辐照食品确证方法进行检测。第三法微生物学筛选法
14术语和定义
内毒素（endotoxin）
革兰氏阴性菌的菌体中存在的毒性物质的总称，是细菌细胞壁上的特有成分，其毒性成分主要为类脂质A。只有在细菌裂解后，内毒素才会释放出来，可引起宿主发热和内毒素休克等症状，5原理
在适宜条件下，细菌内毒素可激活鲨试剂中的凝固酶原，使鲨试剂产生凝集反应形成凝胶。内毒素与革兰氏阴性菌含量呈正相关，所以可根据内毒素的含量测定革兰氏阴性菌的含量食品经过一定剂量的辐照后，食品中的革兰氏阴性细菌基本上被杀死，但残留的内毒素不会因辐照处理而消失。因此可通过内毒素浓度测定，计算被辐照食品中死亡和存活革兰氏阴性细菌的总数，同时对食品中存活的革兰氏阴性细菌进行培养计数，通过两者的差异，可判断食品是否经过辐照。若两个数值的差异明显，表明样品可能接受过辐照。16
试剂和材料
16.1试剂
鲨试剂：灵敏度0.5EU/mL。
注射用无热源生理盐水。
16.2材料
蛋白陈溶液（见C.1)。
营养琼脂培养基（见C.2）。
牛奶琼脂培养基（见C.3.1）。
16.2.4结晶紫溶液（见C.3.2）。16.2.5
青霉素溶液（见C.3.3）。
革兰氏阴性细菌选择性培养基（见C.3.4）。16.3标准品
内毒素标准样品（CAS号1235503）：50EU/管，纯度≥99%。16.4标准溶液配制
GB23748—2016
内毒素标准液：取内毒素标准样品，加入1mL无热源生理盐水，溶解为50EU/mL的标准溶液，17
仪器和设备
可调温水浴锅。
高压灭菌锅。
电子天平：感量0.1g。
恒温干燥箱。
涡旋振荡器
电热恒温培养箱。
均质器：8000r/min~10000r/min。分析步骤
注：样品应在4℃保存.24h内检验。如不能立即检验，应置于一20℃保存，最长保存时间不超过30d18.1制样
无菌条件下，在样品的不同部位取样，共取10g。将样品置于无菌塑料容器中，用一次性针筒加人90mL无热源生理盐水。8000r/min均质1min～2min.制成浓度为10-的样品溶液，4℃保存备用，最长保存时间不超过24h。
18.2革兰氏阴性细菌培养计数
18.2.1培养基制备
制备蛋白陈溶液、营养琼脂培养基、革兰氏阴性菌选择性培养基（见附录C），倾注平板前将融化的培养基于45℃土1℃水浴保温。
18.2.2稀释和培养
18.2.2.1根据样品污染情况，对样品溶液（10-1）作进一步的稀释，用蛋白陈溶液对样品稀释液按照9mL比1mL的体积比进行10倍梯度稀释，得到浓度为10-2～10-5的样品稀释液，18.2.2.2将0.1mL不同稀释度的样品稀释液涂布在琼脂营养板上，室温下，正面向上静置90min每个稀释度做2个平板。
18.2.2.3每个平板覆盖10mL革兰氏阴性菌选择性培养基。水平放置，使琼脂凝固。倒置平板于8
21℃士1℃培养箱中培养24h士1hGB23748—2016
18.2.2.4选择菌落数为15～300的2个连续稀释度平板计数（见表D.1的例1）。每克样品中的革兰氏阴性菌数按式(1)计算：
N=V [n +(0.1Xn2)Xd
式中：
—每克样品中革兰氏阴性细菌数，单位为菌落形成单位每克（CFU/g）；N
长有15个～300个菌落的2个连续稀释度平板的菌落之和；每个平板接种的菌液体积，单位为毫升（mL）；第一个稀释度的计数平板数：
一一第二个稀释度的计数平板数；计数有效平板的第一个稀释度。若只有一个稀释度的平板长有15个～300个菌落时，则n2计为0（见表D.1的例2）。.1)
若所有稀释度的平板菌落数均小于15时，则以菌落数最多的平板的菌落数作为N值的估计值（见表D.1的例3）。
若所有稀释度的平板菌落均未长菌时，结果表示为未检测到革兰氏阴性菌，N值计为0（见表D.1的例4)。
18.3内毒素检测
鲨试剂检测
18.3.1.1萤试剂溶解与分装
按试剂标示量，加人无热源生理盐水溶解，混匀，以每支0.1mL分装于安培瓶内。18.3.1.2样品稀释
使用96孔板稀释样品。每一个样品稀释孔中加人650uL无热源生理盐水。取300μL样品溶液加人到第一个样品稀释孔中，混合均匀，得到10-0.5样品稀释液。将300uL10-0.5样品稀释液加人到第二个样品稀释孔中，得到10-1样品稀释液。再将300L10-1样品稀释液加入到第三个样品稀释孔中，得到10-15样品稀释液。继续稀释，直到最后一个稀释倍数的样品内毒素检测为阴性（见图D.3）。最终的稀释倍数视样品情况而定。
18.3.1.3内毒素标准品溶液稀释将配制好的内毒素标准液按照18.3.2.2中的样品稀释法进行不同倍数的稀释。18.3.1.4萱试剂检测
反应在96孔板中进行。以内毒素标准品溶液作为阳性对照，无热源生理盐水作为阴性对照。每个反应孔中加人0.1mL稀释样品和0.1mL鲨试剂，混勾。盖上96孔板盖子，置于37℃士0.5℃水浴中反应1h。
18.3.2结果计数
当试剂发生完全凝集时记为“十”，部分凝集时记为“十/一”，未凝集时记为“一”。18.3.3
内毒素定量
根据不同稀释倍数内毒素标准品溶液的检测情况确定检测留试剂的灵敏度。以发生凝固的最后一9
GB23748—2016
个样品稀释溶液的滴度用于计算，如果完全凝固时，以实际滴度用于计算（见表D.2中例1），如果为部分凝固“十/一”时，则以该倍数的指数减去0.25后作为滴度值用于计算（见表D.2中例2）。每克样品中内毒素含量按式(2)计算：
式中：
LAL=X10°×10
每克样品中内毒素含量，单位为内毒素单位每克（EU/g）；标准品中内毒素含量，单位为内毒素单位每毫升（EU/mL）；样品的滴度值；
标准品稀释倍数。
分析结果的表述
19.1结果分析
计算IgLAL、IgN和IgLAL一IgN值..............2
IgLAL一IgN>0时，表示样品经检测含有较高的内毒素含量，但经培养的革兰氏阴性菌数目较19.1.2
少或者未检测出有可培养的革兰氏阴性菌1gLAL一IgN值≤0，表示样品经检测含有较高的内毒素含量，且培养的革兰氏阴性菌数目19.1.3
较多。
IgLAL<2表示样品中内毒素含量较低IgN<2表示培养的革兰氏阴性菌数目较少19.1.5
19.2判定结果
IgLAL一lgN>0时，判定该样品可能经过辐照处理。IgLAL一lgN值≤0，判定该样品未经过辐照处理1gLAL<2且lgN<2时，不适用19.2.1和19.2.2判定条件，不可判定样品是否经过辐照处理。10
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