DBS61 0012-2016 食品安全地方标准 蜂蜜中16种激素残留的测定 液相色谱-质谱质谱法 DBS610012-2016 标准压缩包解压密码：www.bzxz.net

陕西省食品安全地方标准
DBS61/0012—2016
食品安全地方标准
蜂蜜中16种激素残留的测定
液相色谱-质谱/质谱法
2016-06-01发布
陕西省卫生和计划生育委员会
2016-07-01实施
本标准按照GB/T1.1给出的规则起草。前言
本标准由中华人民共和国陕西出入境检验检疫局提出。本标准由中华人民共和国陕西出入境检验检疫局负责起草。本标准主要起草人：张璐，李莹，何强，王菌，孔祥虹，邹阳，付骋宇。本标准属首次发布。
DBS61/0012—2016
1范围
食品安全地方标准
DBS61/0012—2016
蜂蜜中16种激素残留的测定液相色谱一质谱/质谱法本标准规定了蜂蜜中16种激素残留的液相色谱-质谱/质谱（LC-MS/MS）的检测方法。本标准适用于蜂蜜中糖皮质激素（曲安西龙、泼尼松龙、氢化可的松、甲基泼尼松龙、地塞米松、氟米松、曲安奈德、醋酸氟氢松、氟氢可的松、醋酸可的松、醋酸地塞米松、醋酸泼尼松）、雄性激素（甲睾酮、睾酮）、孕激素（孕酮）、肾上腺皮质激素（羟基醋酸去皮质酮）16种激素残留定性和定量测定。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T1.1标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写规则GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3原理
试样经酶解，用乙提取目标化合物后，经固相萃取富集净化，液相色谱-质谱/质谱仪测定，外标法定量。
试剂与材料
除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和GB/T6682中规定的一级水。4.1
乙腊：色谱纯。
甲醇：色谱纯。
甲酸：色谱纯。
二氯甲烷。
乙酸铵。
乙酸。
β-葡萄糖醛苷酶/芳香基硫酸酯酶（β-glucuronidase/arylsufastase）：含有β-葡萄糖醛苷酶134600U/mL，芳基硫酸酯酶5200U/mL。4.8
无水硫酸钠：650℃灼烧4h，在干燥器中冷却至室温，贮于密封瓶中备用。乙酸铵溶液（0.2mol/L）：称取15.4g乙酸铵，加入1000mL水溶解，用乙酸调节pH到5.2。1
4.10二氯甲烷-甲醇（6+4，体积比）：60mL二氯已烷和40mL甲醇混合。4.110.1%甲酸水溶液：准确量取1mL甲酸加水稀释至1000mL。4.12乙-水溶液（1+9，体积比）：10mL乙腊和90mL水混合。DBS61/0012—2016
4.13标准品：曲安西龙、泼尼松龙、氢化可的松、甲基泼尼松龙、地塞米松、氟米松、曲安奈德、醋酸氟氢松、氟氢可的松、醋酸可的松、醋酸地塞米松、醋酸泼尼松龙、甲睾酮、睾酮、孕酮、醋酸去氧皮质酮，纯度均大于97%，物质英文名称及CAS号见附录A。4.14标准储备液（1mg/mL）：分别准确称10.0mg各标准品于10mL容量瓶中，用甲醇溶解，摇匀，-18℃避光保存，可保存12个月。4.15混合标准中间溶液（1μg/mL）：分别准确量取1mg/mL标准储备液各0.025mL，于25mL容量瓶中，用水溶解，0℃～4℃避光保存，可保存6个月。4.16混合标准使用溶液：根据需要，临时吸取一定量的混合标准中间溶液（4.15）用水稀释，配制成适当浓度的标准工作溶液0℃～4℃避光保存，可保存6个月。4.17HLB固相萃取柱（60mg，3mL）：使用前依次用6mL二氯甲烷-甲醇（4.10）、6mL甲醇、6mL水活化。
4.18氨基固相萃取柱（60mg，3mL）：使用前用6mL二氯甲烷-甲醇（4.10）活化。仪器与设备
液相色谱-串联质谱仪：配电喷雾离子源。分析天平：感量0.01mg。
天平：感量0.01g。
振荡器
涡旋混匀器
高速离心机
固相萃取装置
氮吹仪
旋转蒸发仪
离心管：50mL。
有机系滤膜：0.22μum。
试样制备与保存
对无结晶的实验室样品，将其搅拌均匀。对有结晶的样品，在封闭情况下，置于不超过60℃的水浴中温热，震荡，待样品全部融化后搅匀，迅速冷却至室温，分出0.5kg作为试样，制备好的样品置于样品瓶中，密封，并做上标记。
7测定步骤
7.1提取
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准确称取试样5g（精确至0.01g），于50mL离心管中，加入20mL0.2mol/L乙酸铵溶液（4.9），涡旋混合，再加入β-葡萄糖醛苷酶/芳香基硫酸酯酶100μL，于37℃土1℃震荡酶解12h。取出冷却至室温，加入20mL乙腈震荡提取15min，4500r/min下离心5min，取乙腈层过无水硫酸钠漏斗。再加入15mL乙腈，重复上述提取过程。合并乙睛层，40℃下旋转蒸发至近干，用10mL0.2mol/L乙酸铵溶液（4.9）溶解，待净化。
7.2净化
提取液（7.1）以1.5mL/min的速度上样于活化过的HLB固相萃取柱（4.17）。将小柱减压抽干。再将活化过的氨基柱（4.18）串联在HLB固相萃取柱下方。用8mL二氯甲烷-甲醇（4.10）洗脱并收集洗脱液，取下HLB小柱，再用2mL二氯甲烷-甲醇（4.10）洗氨基柱，合并洗脱液，于40℃氨气吹干，用1mL乙睛-水（4.12）溶解残渣，涡旋混勾，滤膜（5.11）过滤，供液相色谱-串联质谱测定。7.4测定
液相色谱条件
色谱柱：HypersilGOLDaQ
（2.1x100mm，3.0μm），或相当者：柱温：40℃；
流速：0.3mL/min：
进样量：10.0μL；
流动相：乙腈-0.1%甲酸水，梯度洗脱，洗脱条件参见附录B：糖皮质激素质谱条件
a）电离源：电喷雾离子源：
b）离子化方式：负离子模式：
c）检测模式：选择离子反应监测：d）喷雾电压：2500V；
e）气化温度：300℃；
f）鞘气（Nz）:0.525L/min；
g）辅助气（N2）：4.5L/min；
h）离子传输管温度：300℃；
i）去簇电压：2.0V：
j）碰撞气（Ar）：199.9Mpa。
k）特征离子参见附录c.1。
雄性激素、孕激素、肾上腺皮质激素质谱条件7.4.3
a）电离源：电喷雾离子源：
b）离子化方式：正离子模式：
c）检测模式：选择离子反应监测；d）喷雾电压：3300V；
e）气化温度：300℃；
f）鞘气（Nz）:0.525L/min；
g）辅助气（Nz）：4.5Lmin：
h）离子传输管温度：300℃：
i）去簇电压：2.0V：
j）碰撞气（Ar)：199.9Mpa
k）特征离子参数见附录C.2。
7.4.4测定法
7.4.4.1定性测定
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通过试样色谱图的保留时间与相应标准品的保留时间、各色谱峰的特征离子与响应浓度标准溶液各色谱峰的特征离子相对照定性，试样与标准品保留时间的相对偏差不大于5%：试样特征离子的相对丰度与浓度相当混合标准溶液的相对丰度一致，相对丰度允许偏差不超过表1的规定，则可判断试样中存在相应的被测物。
表1试样溶液中离子相对丰度的允许偏差范围相对丰度（%）
允许偏差（%）
7.4.4.2定量测定
>20~50
>10～20
根据试样中被测样液的含量情况，按外标法，以峰面积定量。选取待测物的响应值在仪器线性响应范围内的浓度进行测定，如果超出仪器线性响应范围应进行稀释。在上述条件下，标准溶液中各目标化合物的特征离子流色谱图见附录D。7.5平行试验
按照7.1至7.4所述的测定条件和步骤对同一试样进行平行试验测定。7.6空白试验
除不称取试样外，均按7.1至7.4所述的测定条件和步骤进行。结果计算和表达
试样中各目标化合物残留量（μg/kg）：按式（1）计算：X
式中：
AxCs×V
x一供试试样中各目标化合物残留量，单位为微克每千克（ug/kg）；A一试样溶液中各目标化合物的峰面积：Cs一标准工作溶液中各目标化合物的浓度，单位为微克每升（ug/L）：V一样液最终定容体积，单位为毫升（mL）：As一标准工作溶液中各目标化合物的浓度，单位为微克每升（μg/L）；m一试样质量，单位为克（g）
注：计算结果需扣除空白值，测定结果用平行测定的算术平均值表示，保留两位有效数字。9
定量限、回收率和精密度
检出限
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本方法曲安西龙、泼尼松龙、氢化可的松、甲基泼尼松龙、地塞米松、氟米松、曲安奈德、醋酸氟氢松、氟氢可的松、醋酸可的松、醋酸地塞米松、甲睾酮、睾酮、孕酮、醋酸去氧皮质酮检出限均为1.0ug/kg，醋酸泼尼松检出限为2.0 ug/kg9.2
回收率
蜂蜜中各种激素的回收率试验数据见附录E，在1.0~5.0μg/kg添加水平上的回收率范围为68.2%~102.2%
精密度
本方法的相对标准偏差≤15%。
（规范性附录）
16种激素物质的CAS号、分子式、分子量及英文名称
A.116种激素物质的CAS号、
分子量及英文名称
分子式、：
应符合表A.1的规定。
化合物
醋酸泼尼松龙PrednisoloneAcetate醋酸可的松Cortisone Acetate
泼尼松龙Prednisolone
氢化可的松Hydrocortisone
甲基泼尼松龙Methylprednisolone醋酸地塞米松DexamethasoneAcetate地塞米松Dexamethasone
曲安西龙Triamcinolone
氟米松Flumethasone
氟氢可的松Fludrocortisone
曲安奈德Triamcinolone Acetonide醋酸氟氢松FluocinoloneAcetonide翠酮Testosterone
甲率酮Methyltestosterone
孕酮Progesterone
醋酸去氧皮质酮
CAS号
52-21-1
50-04-4
50-24-8
50-23-7
83-43-2
55812-90-3
50-02-2
124-94-7
2135-17-3
127-31-1
76-25-5
67-73-2
58-22-0
58-18-4
57-83-0
56-47-3
分子式
C2sHgO
C23HOg
C2/H2gOs
C2HsOs
C24Hs,FO
C2H2FOs
C2,H2,FO
C22H2sF2Os
C2,H2gFOs
CaHa,FO
C24H3oF20
CjgH2gO2
CoHg02
C2:Hs204
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分子量
B.116种激素的参考液相色谱条件应符合表B.1的规定。
时间/min
（资料性附录）
参考液相色谱条件
乙腈/%bzxz.net
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0.1%甲酸水/%
参考质谱条件
应符合表C.1和表C.2的规定。
化合物
醋酸泼尼松龙
醋酸可的松
泼尼松龙
氨化可的松
甲基泼尼松龙
醋酸地塞米松
地塞米松
曲安西龙
氟米松
氟氢可的松
曲安奈德
醋酸氟氢松
注：对不同质谱仪器，
“为定量离子。
保留时间
（资料性附录）
参考质谱条件1》
母离子
子离子
S-Lens电压
仪器参数可能存在差异，
测定前应将质谱参数优化到最佳。DBS61/0012—2016
碰撞电压
1）非商业性声明：附录D中所列参考质谱条件是在ThermoTSQVantage质谱仪上完成的，此处列出试验用仪器型号仅为提供参考，并不涉及商业目的，重鼓励标准使用者尝试不同厂家及型号的仪器。8
化合物
甲睾酮
醋酸去氧皮质酮
孕激素、肾上腺皮质激素参考质谱条件表C.2雄性激素、
保留时间
母离子
子离子
S-Lens 电压
对不同质谱仪器，
测定前应将质谱参数优化到最佳，注：
仪器参数可能存在差异，
为定量离子。
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碰撞电压
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