GB∕T 15670.15-2017
基本信息
标准号： GB∕T 15670.15-2017
中文名称：农药登记毒理学试验方法 第15部分：体内哺乳动物骨髓嗜多染红细胞微核试验
标准类别：国家标准(GB)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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相关标签： 农药 登记 试验 方法 体内 哺乳动物 骨髓 红细胞 核试验
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标准简介
GB∕T 15670.15-2017 农药登记毒理学试验方法 第15部分：体内哺乳动物骨髓嗜多染红细胞微核试验
GB∕T15670.15-2017
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标准内容
ICS65.100
中华人民共和国国家标准
GB/T15670.15—2017
部分代替GB/T15670—-1995
农药登记毒理学试验方法
第15部分：体内哺乳动物骨髓嗜多染红细胞微核试验
Toxicological test methods for pesticides registration-Part 15: In vivo mammalian bone marrow polychromatic erythrocytemicronucleus test
2017-07-12发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
2018-02-01实施
GB/T15670《农药登记毒理学试验方法》分为以下部分：第1部分：总则；
第2部分：急性经口毒性试验
霍恩氏法；
序贯法；
第3部分：急性经口毒性试验
第4部分：急性经口毒性试验
概率单位法；
第5部分：急性经皮毒性试验；
第6部分：急性吸入毒性试验；
第7部分：皮肤刺激性/腐蚀性试验；第8部分：急性眼刺激性/腐蚀性试验；第9部分：皮肤变态反应（致敏）试验；第10部分：短期重复经口染毒（28天）毒性试验；第11部分：短期重复经皮染毒（28天）毒性试验；第12部分：短期重复吸入染毒（28天）毒性试验；第13部分：亚慢性毒性试验：
第14部分：细菌回复突变试验；第15部分：体内哺乳动物骨髓嗜多染红细胞微核试验；第16部分：体内哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验；第17部分：哺乳动物精原细胞/精母细胞染色体畸变试验；第18部分：啮齿类动物显性致死试验；第19部分：体外哺乳动物细胞染色体畸变试验；第20部分：体外哺乳动物细胞基因突变试验；第21部分：体内哺乳动物肝细胞程序外DNA合成（UDS)试验；GB/T15670.15—2017
第22部分：体外哺乳动物细胞DNA损害与修复/程序外DNA合成试验；第23部分：致畸试验；
第24部分：两代繁殖毒性试验；第25部分：急性迟发性神经毒性试验；第26部分：慢性毒性试验；
第27部分：致癌试验；
第28部分：慢性毒性与致癌合并试验：第29部分：代谢和毒物动力学试验。本部分为GB/T15670的第15部分。本部分按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本部分部分代替GB/T156701995《农药登记毒理学试验方法》。本部分与GB/T15670—1995的小鼠骨髓多染红细胞微核试验部分相比主要变化如下：修改和调整了标准的总体结构和编排格式：增加了一些章节内容（见第1章、第2章、第3章、第4章、第5章、7.1和第8章）；修改了对实验动物的要求（见6.2，1995年版的14.4.1）；修改了剂量和分组的内容（见6.3，1995年版的14.4.3）；I
GB/T15670.15—2017
修改了染毒方式内容（见6.4，1995年版的14.4.3）；修改了阅片的内容（见6.7，1995年版的14.4.4.4）。本部分由中华人民共和国农业部提出并归口。本部分起草单位：农业部农药检定所。本部分主要起草人：肖杭、环飞、张丽英、陶传江。本部分所代替标准的历次版本发布情况为：GB/T15670-1995。
-KAoNrKAca
1范围
农药登记毒理学试验方法
第15部分：体内哺乳动物骨髓嗜多染红细胞微核试验
GB/T15670.15—2017
GB/T15670的本部分规定了体内哺乳动物骨髓嗜多染红细胞微核试验的基本原则、方法和要求。本部分适用于为农药登记而进行的体内哺乳动物骨髓嗜多染红细胞微核试验2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仪注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB14925实验动物环境及设施
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。3.1
微核micronucleus
在细胞有丝分裂后期，不能进入子代细胞核中的染色体的断片或迟滞的染色体，在子代细胞胞浆内形成的一个或几个次核，其与细胞主核着色一致，呈圆形或椭圆形。3.2
暗多染红细胞polychromaticerythrocytesPCE未成熟红细胞，是红细胞成熟过程中的一个中间阶段，此时因胞质内仍含有核糖体，保持其嗜碱性约24h，可通过选择性的染色而与成熟红细胞区别开来。3.3此内容来自标准下载网
正染红细胞
normochromaticerythrocytes;NCE成熟红细胞，因其核糖体消失，可通过选择性的染色而与未成熟红细胞区别开来。4试验目的
检测受试物是否引起哺乳动物骨髓嗜多染红细胞染色体或有丝分裂器损伤而诱导微核细胞发生率增高，以评价受试物致突变的可能性。5试验概述
微核是指细胞中主核之外的小核，染色与细胞核一致，相当于细胞直径的1/20～1/5，呈圆形或椭圆形。微核是细胞内染色体断裂或纺锤丝受影响而在细胞有丝分裂时滞留在胞核外的遗传物质。因1
TYKAONIKAca
GB/T15670.15—2017
而，微核试验能检测化学或/和其他物理因素诱导产生的染色体完整性改变和染色体分离改变这两种遗传学终点。
微核可出现于多种细胞，但在有核细胞中难与正常核的分叶及核突出物区分，故常计数嗜多染红细胞（PCE)中的微核，因为红细胞在成熟之前最后一次分裂后数小时将主核排出，但仍保留微核于嗜多染红细胞中。
6试验方法
6.1受试物及仪器试剂
6.1.1受试物配制
首选蒸馏水作溶剂，如受试物不溶于水，可用食用油、食用淀粉、0.5羧甲基纤维素钠配成乳浊液或悬浊液，受试物应于灌胃前新鲜配制，除非有资料表明以溶液（或乳浊液、悬浊液）保存具有稳定性。如不是常用溶剂，应有参考资料并说明其成分及选做溶剂的原因。仪器及其他试剂
仪器：生物显微镜恒温水浴箱等。小牛血清（灭活）小牛血清滤菌后置于56C担温水浴保温30m进行灭活。灭活的小牛血清通常贮
C冰箱。亦可用大小鼠面清代替。姬姆萨（Giemsa）染液：
姬姆萨（Giemsa)染料
配制将姬姆萨（Giems染料和少量甲醇置于研钵里仔细研磨寒加人甲醇到375mL，待完全溶解后，再加人125mL甘油混合均纤溶解。取出过滤，两周后使用。6.1.2.4磷酸盐缓冲液（H6.8）
1/15mol//磷酸氢
高温箱中保温48五，保温期间振择数次，促使染料充分钠溶液：称取NazHPO,9.47g溶于1000mL蒸馏水巾1/15mol/L磷酸二
钾溶液：称取KH.PO,9.07g溶于1000mL蒸馅水中将磷酸氢二钠溶液50mL与磷酸二氢钾溶液50mL混合，用pH计测定并调节至pH6.8。6.1.2.5姬姆萨（Giemsa）应用液：取1份姬姆萨（Giemsa）染液与6份磷酸盐缓冲液（pH6.8）混合而成，临用时配制。
6.1.2.6甲醇（分析纯）。
6.2实验动物
6.2.1动物选择
微核试验推荐使用小鼠，也可选用大鼠。通常用7周～12周，体重25g～30g的小鼠或体重150g~200g的大鼠。动物随机分组，每组用两种性别的动物至少各5只。在试验开始时，动物体重差异应不超过同性别平均体重的士20%
6.2.2饲养环境
试验前，动物应在饲养环境中检疫、适应3d～5d。实验动物养环境应符合GB14925的有关规定。
-TTKAONIKAca
6.3剂量与分组
6.3.1剂量设计原则
GB/T15670.15—2017
高剂量组动物应出现严重中毒效应和/或个别出现死亡，低剂量组动物应不出现毒性效应，即覆盖最高毒性至几乎无毒。一般高剂量取1/2LDso，中、低剂量分别取1/4LDsg、1/8LDs0。第一个采样时间点应设3个剂量，第二个采样时间点仅需设高剂量。对有特异生物学活性的受试物（如激素和促细胞分裂剂）可应用其他剂量设计原则，高剂量可采用能在骨髓中产生明显毒性的剂量（如在骨髓细胞中嗜多染红细胞比例降低）。6.3.2限量试验
如果单次染毒（或同一天2次染毒）剂量在2000mg/kg体重以上仍不产生可观察到的毒性效应，并且根据结构相关化合物的资料预期无遗传毒性，则不需要进行3个剂量水平的试验，仅进行限量试验。对于限量试验，染毒时间在14d内的，剂量设为2000mg/kg体重，染毒时间长于14d的，剂量设为1000mg/kg体重。如果人类的可能（预期）暴露量过大，限量试验应以000mg/kg体重剂量水平进行或选择更高的剂量
6.3.3对照组设定
6.3.3.1每次试验每一性别都应设置相应的阻性对照和阴性对照（落剂载体）除了不给子受试物染毒外，对照组动物应与染毒组动物以相间方式进行操作。阳性对照组应预期可检测到超过本底有的有微核的红细脑预率增加证实试验系统敏感性。6.3.3.2
阳性对照的染毒途径可不同受试物的染毒途径并且仅于单个时间点采样
结构相关的阳性对照，常用阳性对照物参照附录最好使用与受试物化学
6.3.3.3阴性对照为溶剂对照依据动物间的变异和染色体畸变细胞顺率的本底对照资料，判断是否在每个采样时间点均设置阴性对照组，并用与染毒组同样的方式处置，如果阴性对照采用单次采样，则最适宜采样时间为首次采样日间，如果没有所史对则应增设空白对照。
6.4染毒方式
照资料证明所用溶剂无细胞毒性或无致突变作用，6.4.1常采用经口灌胃或腹腔注射染毒。其他合理的染毒途径也可接受，一次灌青或注射染毒的最
大液体容积应不超过2mL/100g体重。利用更高容积，应说明理由。一般推荐等容积染毒。6.4.2试验可以用以下任一种方式进行染毒：以受试物1次染毒动物，于24h~48h之间采集骨髓样品至少2次，早于24h采样应说明a)
理由；
每天1次染毒，共2次或多次（间隔24h）染毒，可在末次染毒后18h~24h之间采集骨髓b）
一次。
6.5制片
颈椎脱白方法处死动物，取胸骨，然后用小止血钳挤出骨髓液，与载物片一端的胎牛血清液混匀，按常规涂片，或取出股骨用小牛血清冲洗股骨骨髓腔制成细胞悬液涂片，涂片在空气中晾干后放入甲醇溶液固定5min10min，取出晾干。
6.6染色
用新鲜配制的Giemsa应用液染色10min～15min，立即用pH6.8磷酸盐缓冲液冲洗，晾干，写好标签，阴凉干燥处保存。
-TTKAONTKAca
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6.7阅片
先在低倍镜下观察，选择分布均匀、染色较好的区域，再在油镜下观察计数。嗜多染红细胞呈灰蓝色，止染红细胞（NCE）呈淡橘红色。典型微核大多数呈单个圆形，边缘光滑整齐，嗜色性与核质一致，呈紫红色或蓝紫色，直径通常为红细胞的1/20~1/5。每只动物计数1000个嗜多染红细胞中含有微核的嗜多染红细胞，即微核率，以千分率表示，观察嗜多染红细胞与红细胞总数（嗜多染红细胞十正染红细胞），可作为细胞毒性指标之一。至少计数200个红细胞，并计算PCE/（PCE+NCE）比值，受试物组嗜多染红细胞占红细胞总数的比例不应少于对照组的20%。
7试验结果和评价
7.1试验结果
以直接计数1000个嗜多染红细胞中含有微核的嗜多染红细胞的多少而定。每一动物为一观察单位，每组雌雄动物分别计算含微核的嗜多染红细胞的均值。试验结果可采用泊松分布U检验统计，也可采用X2检验、双侧1检验等统计方法进行数据处理。如动物连续染毒4周或更长时间，也应给出正染红细胞的数据。雌雄之间无明显的性别差异时可合并计算，否则应分别计算。7.2试验结果的评价
7.2.1试验组与对照组相比，试验结果微核率增加有统计学意义并有剂量-反应关系时，即可确认为阳性结果。若统计学上差异有显著性，但无剂量-反应关系时，则应进行重复试验。结果能重复者可确定为阳性。应有本实验室所用实验动物的白发微核率作参考7.2.2结果不符合上述标准的受试物可认为在本试验系统中为阴性结果。7.2.3微核试验阳性结果表明在试验条件下，受试物可引起实验动物成红细胞染色体损害或有丝分裂器损害产生微核率增加；阴性结果表明在试验条件下，受试物不引起实验动物嗜多染红细胞微核率增加。
8试验报告
试验报告至少应包括以下内容：a）试验名称、试验单位名称和联系方式、报告编号；b）试验委托单位名称和联系方式、样品受理日期和封样情况；试验开始和结束日期、试验项目负责人、试验单位技术负责人、签发日期；c）
d）试验摘要；
受试物名称、有效成分美国化学文摘登录号（CAS号）（如已知）、代码（如有）、纯度（或含量）、e
剂型、生产日期（批号）、理化性质、配制所用溶剂和方法：实验动物种属、品系、级别、数量、体重、性别、来源（供应商名称、实验动物质量合格证号、实验动物生产许可证号），检疫、适应情况，实验动物饲养环境，包括温度、相对湿度、饲料、单笼饲养或群饲、实验动物设施使用许可证号；g）剂量和组别，包括选择剂量的原则或依据、剂量和组别、动物分组方式和每组每种性别动物数；试验条件和方法，包括主要仪器设备、染毒途径、染毒方案、操作步骤、阳性对照物名称等；h)
试验结果：以文字描述和表格逐项进行汇总，中毒表现，各组有微核的嗜多染红细胞的均数和标准差，嗜多染红细胞在总红细胞中比例，剂量-反应关系，统计学分析；试验结论：给出受试物在试验条件下是否有致突变作用的结论，必要时对有关问题进行讨论，j
原始记录保存情况的说明。
-KAoNiKAca
阳性对照物
三亚乙基密胺（tricthylenemelamine）甲磺酸乙酯（ethylmethanesulfonate)乙基亚硝基脲（ethylnitrosourea）丝裂霉素C(mitomycinC)
环磷酰胺（cyclophosphamide）录
（资料性附录）
常用阳性对照物
常用阳性对照物
CAS号
51-18-3
62-50-0
759-73-9
50-07-7
50-18-0
GB/T15670.15—2017
参考剂量与途径
1.0mg/kg体重（ip）
60mg/kg体重（ip）
1.5mg/kg体重~2.0mg/kg体重（ip）40mg/kg体重（ig）或30mg/kg体重（ip）5
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GB/T15670.15-2017
中华人民共和国
国家标准
农药登记毒理学试验方法
第15部分：体内哺乳动物骨髓嗜多染红细胞微核试验
GB/T15670.152017
中国标准出版社出版发行
北京市朝阳区和平里西街甲2号（100029）北京市西城区三里河北街16号（100045）网址spc.net.cn
总编室：（010)68533533发行中心：（010)51780238读者服务部：（010)68523946
中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销
开本880×12301/16印张0.75字数14千字2017年7月第一版
反2017年7月第一次印刷
书号：155066·1-54022定价16.00元如有印装差错
由本社发行中心调换
版权专有侵权必究
举报电话：（010)68510107
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中华人民共和国国家标准
GB/T15670.15—2017
部分代替GB/T15670—-1995
农药登记毒理学试验方法
第15部分：体内哺乳动物骨髓嗜多染红细胞微核试验
Toxicological test methods for pesticides registration-Part 15: In vivo mammalian bone marrow polychromatic erythrocytemicronucleus test
2017-07-12发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
2018-02-01实施
GB/T15670《农药登记毒理学试验方法》分为以下部分：第1部分：总则；
第2部分：急性经口毒性试验
霍恩氏法；
序贯法；
第3部分：急性经口毒性试验
第4部分：急性经口毒性试验
概率单位法；
第5部分：急性经皮毒性试验；
第6部分：急性吸入毒性试验；
第7部分：皮肤刺激性/腐蚀性试验；第8部分：急性眼刺激性/腐蚀性试验；第9部分：皮肤变态反应（致敏）试验；第10部分：短期重复经口染毒（28天）毒性试验；第11部分：短期重复经皮染毒（28天）毒性试验；第12部分：短期重复吸入染毒（28天）毒性试验；第13部分：亚慢性毒性试验：
第14部分：细菌回复突变试验；第15部分：体内哺乳动物骨髓嗜多染红细胞微核试验；第16部分：体内哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验；第17部分：哺乳动物精原细胞/精母细胞染色体畸变试验；第18部分：啮齿类动物显性致死试验；第19部分：体外哺乳动物细胞染色体畸变试验；第20部分：体外哺乳动物细胞基因突变试验；第21部分：体内哺乳动物肝细胞程序外DNA合成（UDS)试验；GB/T15670.15—2017
第22部分：体外哺乳动物细胞DNA损害与修复/程序外DNA合成试验；第23部分：致畸试验；
第24部分：两代繁殖毒性试验；第25部分：急性迟发性神经毒性试验；第26部分：慢性毒性试验；
第27部分：致癌试验；
第28部分：慢性毒性与致癌合并试验：第29部分：代谢和毒物动力学试验。本部分为GB/T15670的第15部分。本部分按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本部分部分代替GB/T156701995《农药登记毒理学试验方法》。本部分与GB/T15670—1995的小鼠骨髓多染红细胞微核试验部分相比主要变化如下：修改和调整了标准的总体结构和编排格式：增加了一些章节内容（见第1章、第2章、第3章、第4章、第5章、7.1和第8章）；修改了对实验动物的要求（见6.2，1995年版的14.4.1）；修改了剂量和分组的内容（见6.3，1995年版的14.4.3）；I
GB/T15670.15—2017
修改了染毒方式内容（见6.4，1995年版的14.4.3）；修改了阅片的内容（见6.7，1995年版的14.4.4.4）。本部分由中华人民共和国农业部提出并归口。本部分起草单位：农业部农药检定所。本部分主要起草人：肖杭、环飞、张丽英、陶传江。本部分所代替标准的历次版本发布情况为：GB/T15670-1995。
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1范围
农药登记毒理学试验方法
第15部分：体内哺乳动物骨髓嗜多染红细胞微核试验
GB/T15670.15—2017
GB/T15670的本部分规定了体内哺乳动物骨髓嗜多染红细胞微核试验的基本原则、方法和要求。本部分适用于为农药登记而进行的体内哺乳动物骨髓嗜多染红细胞微核试验2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仪注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB14925实验动物环境及设施
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。3.1
微核micronucleus
在细胞有丝分裂后期，不能进入子代细胞核中的染色体的断片或迟滞的染色体，在子代细胞胞浆内形成的一个或几个次核，其与细胞主核着色一致，呈圆形或椭圆形。3.2
暗多染红细胞polychromaticerythrocytesPCE未成熟红细胞，是红细胞成熟过程中的一个中间阶段，此时因胞质内仍含有核糖体，保持其嗜碱性约24h，可通过选择性的染色而与成熟红细胞区别开来。3.3此内容来自标准下载网
正染红细胞
normochromaticerythrocytes;NCE成熟红细胞，因其核糖体消失，可通过选择性的染色而与未成熟红细胞区别开来。4试验目的
检测受试物是否引起哺乳动物骨髓嗜多染红细胞染色体或有丝分裂器损伤而诱导微核细胞发生率增高，以评价受试物致突变的可能性。5试验概述
微核是指细胞中主核之外的小核，染色与细胞核一致，相当于细胞直径的1/20～1/5，呈圆形或椭圆形。微核是细胞内染色体断裂或纺锤丝受影响而在细胞有丝分裂时滞留在胞核外的遗传物质。因1
TYKAONIKAca
GB/T15670.15—2017
而，微核试验能检测化学或/和其他物理因素诱导产生的染色体完整性改变和染色体分离改变这两种遗传学终点。
微核可出现于多种细胞，但在有核细胞中难与正常核的分叶及核突出物区分，故常计数嗜多染红细胞（PCE)中的微核，因为红细胞在成熟之前最后一次分裂后数小时将主核排出，但仍保留微核于嗜多染红细胞中。
6试验方法
6.1受试物及仪器试剂
6.1.1受试物配制
首选蒸馏水作溶剂，如受试物不溶于水，可用食用油、食用淀粉、0.5羧甲基纤维素钠配成乳浊液或悬浊液，受试物应于灌胃前新鲜配制，除非有资料表明以溶液（或乳浊液、悬浊液）保存具有稳定性。如不是常用溶剂，应有参考资料并说明其成分及选做溶剂的原因。仪器及其他试剂
仪器：生物显微镜恒温水浴箱等。小牛血清（灭活）小牛血清滤菌后置于56C担温水浴保温30m进行灭活。灭活的小牛血清通常贮
C冰箱。亦可用大小鼠面清代替。姬姆萨（Giemsa）染液：
姬姆萨（Giemsa)染料
配制将姬姆萨（Giems染料和少量甲醇置于研钵里仔细研磨寒加人甲醇到375mL，待完全溶解后，再加人125mL甘油混合均纤溶解。取出过滤，两周后使用。6.1.2.4磷酸盐缓冲液（H6.8）
1/15mol//磷酸氢
高温箱中保温48五，保温期间振择数次，促使染料充分钠溶液：称取NazHPO,9.47g溶于1000mL蒸馏水巾1/15mol/L磷酸二
钾溶液：称取KH.PO,9.07g溶于1000mL蒸馅水中将磷酸氢二钠溶液50mL与磷酸二氢钾溶液50mL混合，用pH计测定并调节至pH6.8。6.1.2.5姬姆萨（Giemsa）应用液：取1份姬姆萨（Giemsa）染液与6份磷酸盐缓冲液（pH6.8）混合而成，临用时配制。
6.1.2.6甲醇（分析纯）。
6.2实验动物
6.2.1动物选择
微核试验推荐使用小鼠，也可选用大鼠。通常用7周～12周，体重25g～30g的小鼠或体重150g~200g的大鼠。动物随机分组，每组用两种性别的动物至少各5只。在试验开始时，动物体重差异应不超过同性别平均体重的士20%
6.2.2饲养环境
试验前，动物应在饲养环境中检疫、适应3d～5d。实验动物养环境应符合GB14925的有关规定。
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6.3剂量与分组
6.3.1剂量设计原则
GB/T15670.15—2017
高剂量组动物应出现严重中毒效应和/或个别出现死亡，低剂量组动物应不出现毒性效应，即覆盖最高毒性至几乎无毒。一般高剂量取1/2LDso，中、低剂量分别取1/4LDsg、1/8LDs0。第一个采样时间点应设3个剂量，第二个采样时间点仅需设高剂量。对有特异生物学活性的受试物（如激素和促细胞分裂剂）可应用其他剂量设计原则，高剂量可采用能在骨髓中产生明显毒性的剂量（如在骨髓细胞中嗜多染红细胞比例降低）。6.3.2限量试验
如果单次染毒（或同一天2次染毒）剂量在2000mg/kg体重以上仍不产生可观察到的毒性效应，并且根据结构相关化合物的资料预期无遗传毒性，则不需要进行3个剂量水平的试验，仅进行限量试验。对于限量试验，染毒时间在14d内的，剂量设为2000mg/kg体重，染毒时间长于14d的，剂量设为1000mg/kg体重。如果人类的可能（预期）暴露量过大，限量试验应以000mg/kg体重剂量水平进行或选择更高的剂量
6.3.3对照组设定
6.3.3.1每次试验每一性别都应设置相应的阻性对照和阴性对照（落剂载体）除了不给子受试物染毒外，对照组动物应与染毒组动物以相间方式进行操作。阳性对照组应预期可检测到超过本底有的有微核的红细脑预率增加证实试验系统敏感性。6.3.3.2
阳性对照的染毒途径可不同受试物的染毒途径并且仅于单个时间点采样
结构相关的阳性对照，常用阳性对照物参照附录最好使用与受试物化学
6.3.3.3阴性对照为溶剂对照依据动物间的变异和染色体畸变细胞顺率的本底对照资料，判断是否在每个采样时间点均设置阴性对照组，并用与染毒组同样的方式处置，如果阴性对照采用单次采样，则最适宜采样时间为首次采样日间，如果没有所史对则应增设空白对照。
6.4染毒方式
照资料证明所用溶剂无细胞毒性或无致突变作用，6.4.1常采用经口灌胃或腹腔注射染毒。其他合理的染毒途径也可接受，一次灌青或注射染毒的最
大液体容积应不超过2mL/100g体重。利用更高容积，应说明理由。一般推荐等容积染毒。6.4.2试验可以用以下任一种方式进行染毒：以受试物1次染毒动物，于24h~48h之间采集骨髓样品至少2次，早于24h采样应说明a)
理由；
每天1次染毒，共2次或多次（间隔24h）染毒，可在末次染毒后18h~24h之间采集骨髓b）
一次。
6.5制片
颈椎脱白方法处死动物，取胸骨，然后用小止血钳挤出骨髓液，与载物片一端的胎牛血清液混匀，按常规涂片，或取出股骨用小牛血清冲洗股骨骨髓腔制成细胞悬液涂片，涂片在空气中晾干后放入甲醇溶液固定5min10min，取出晾干。
6.6染色
用新鲜配制的Giemsa应用液染色10min～15min，立即用pH6.8磷酸盐缓冲液冲洗，晾干，写好标签，阴凉干燥处保存。
-TTKAONTKAca
GB/T15670.15—2017
6.7阅片
先在低倍镜下观察，选择分布均匀、染色较好的区域，再在油镜下观察计数。嗜多染红细胞呈灰蓝色，止染红细胞（NCE）呈淡橘红色。典型微核大多数呈单个圆形，边缘光滑整齐，嗜色性与核质一致，呈紫红色或蓝紫色，直径通常为红细胞的1/20~1/5。每只动物计数1000个嗜多染红细胞中含有微核的嗜多染红细胞，即微核率，以千分率表示，观察嗜多染红细胞与红细胞总数（嗜多染红细胞十正染红细胞），可作为细胞毒性指标之一。至少计数200个红细胞，并计算PCE/（PCE+NCE）比值，受试物组嗜多染红细胞占红细胞总数的比例不应少于对照组的20%。
7试验结果和评价
7.1试验结果
以直接计数1000个嗜多染红细胞中含有微核的嗜多染红细胞的多少而定。每一动物为一观察单位，每组雌雄动物分别计算含微核的嗜多染红细胞的均值。试验结果可采用泊松分布U检验统计，也可采用X2检验、双侧1检验等统计方法进行数据处理。如动物连续染毒4周或更长时间，也应给出正染红细胞的数据。雌雄之间无明显的性别差异时可合并计算，否则应分别计算。7.2试验结果的评价
7.2.1试验组与对照组相比，试验结果微核率增加有统计学意义并有剂量-反应关系时，即可确认为阳性结果。若统计学上差异有显著性，但无剂量-反应关系时，则应进行重复试验。结果能重复者可确定为阳性。应有本实验室所用实验动物的白发微核率作参考7.2.2结果不符合上述标准的受试物可认为在本试验系统中为阴性结果。7.2.3微核试验阳性结果表明在试验条件下，受试物可引起实验动物成红细胞染色体损害或有丝分裂器损害产生微核率增加；阴性结果表明在试验条件下，受试物不引起实验动物嗜多染红细胞微核率增加。
8试验报告
试验报告至少应包括以下内容：a）试验名称、试验单位名称和联系方式、报告编号；b）试验委托单位名称和联系方式、样品受理日期和封样情况；试验开始和结束日期、试验项目负责人、试验单位技术负责人、签发日期；c）
d）试验摘要；
受试物名称、有效成分美国化学文摘登录号（CAS号）（如已知）、代码（如有）、纯度（或含量）、e
剂型、生产日期（批号）、理化性质、配制所用溶剂和方法：实验动物种属、品系、级别、数量、体重、性别、来源（供应商名称、实验动物质量合格证号、实验动物生产许可证号），检疫、适应情况，实验动物饲养环境，包括温度、相对湿度、饲料、单笼饲养或群饲、实验动物设施使用许可证号；g）剂量和组别，包括选择剂量的原则或依据、剂量和组别、动物分组方式和每组每种性别动物数；试验条件和方法，包括主要仪器设备、染毒途径、染毒方案、操作步骤、阳性对照物名称等；h)
试验结果：以文字描述和表格逐项进行汇总，中毒表现，各组有微核的嗜多染红细胞的均数和标准差，嗜多染红细胞在总红细胞中比例，剂量-反应关系，统计学分析；试验结论：给出受试物在试验条件下是否有致突变作用的结论，必要时对有关问题进行讨论，j
原始记录保存情况的说明。
-KAoNiKAca
阳性对照物
三亚乙基密胺（tricthylenemelamine）甲磺酸乙酯（ethylmethanesulfonate)乙基亚硝基脲（ethylnitrosourea）丝裂霉素C(mitomycinC)
环磷酰胺（cyclophosphamide）录
（资料性附录）
常用阳性对照物
常用阳性对照物
CAS号
51-18-3
62-50-0
759-73-9
50-07-7
50-18-0
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参考剂量与途径
1.0mg/kg体重（ip）
60mg/kg体重（ip）
1.5mg/kg体重~2.0mg/kg体重（ip）40mg/kg体重（ig）或30mg/kg体重（ip）5
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GB/T15670.15-2017
中华人民共和国
国家标准
农药登记毒理学试验方法
第15部分：体内哺乳动物骨髓嗜多染红细胞微核试验
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开本880×12301/16印张0.75字数14千字2017年7月第一版
反2017年7月第一次印刷
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