标准号：GB/T 38171-2019
标准名称：金属螯合层析介质
英文名称：Metal chelating chromatographic medium
标准格式：PDF
发布时间：2019-10-18
实施时间：2019-10-18
标准大小：849K
标准介绍：本标准规定了金属螯合层析介质的分类、技术要求、检测方法、检验规则、标签、标志、包装、运输
本标准适用于金属螯合层析介质的生产与检测
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文
件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件
GB/T191包装储运图示标志
GB/T5475离子交换树脂取样方法
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
中华人民共和国药典(2015年版) 本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草
本标准由中国标准化研究院提出并归口。
本标准起草单位：中国科学院过程工程研究所、中国标准化研究院、中科森辉微球技术(苏州)有限
本标准主要起草人：黄永东、赵岚、朱凯、吴学星、马光辉、苏志国、巩方玲、马爱进、杨维兴、王少云。
本标准规定了金属螯合层析介质的分类、技术要求、检测方法、检验规则、标签、标志、包装、运输和贮存。 本标准适用于金属螯合层析介质的生产与检测。

ICS07.080
中华人民共和国国家标准
GB/T38171—2019
金属螯合层析介质
Metal chelating chromatographic medium2019-10-18发布
国家市场监督管理总局
中国国家标准化管理委员会
2019-10-18实施
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草本标准由中国标准化研究院提出并归口。GB/T38171—2019
本标准起草单位：中国科学院过程工程研究所、中国标准化研究院、中科森辉微球技术（苏州）有限公司。
本标准主要起草人：黄永东、赵岚、朱凯、吴学星、马光辉、苏志国、巩方玲、马爱进、杨维兴、王少云。1
1范围
金属螯合层析介质
GB/T38171—2019
本标准规定了金属螯合层析介质的分类、技术要求、检测方法、检验规则、标签、标志、包装、运输和存。
本标准适用于金属鳌合层析介质的生产与检测规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T191
包装储运图示标志
离子交换树脂取样方法
GB/T5475
GB/T6682
分析实验室用水规格和试验方法中华人民共和国药典（2015年版）3
术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。金属螯合层析介质
metal chelatingchromatographicmedium将亚氨基二乙酸或者次氮基三乙酸键合在琼脂糖分离介质上，再螯合金属离子Ni2+（或其他金属离子）而形成的一类层析介质。4分类
按螯合剂种类分为亚氨基二乙酸型金属螯合层析介质（IDA）和次氮基三乙酸型金属螯合层析介质(NTA)。
技术要求
外观要求
金属螯合层析介质应球形饱满、表面光滑，在光学显微镜下应具有透明性。5.2
性能要求
应符合表1中的规定。
GB/T 38171—2019
金属螯合层析介质的主要性能要求指标
范围粒径比（W粒薇）/%
平均粒径(a)/μm
最高流速/（cm/h）
配基密度/（μmol/mL）
动态载量（Qso%）d/（mg/mL）
菌落总数/（CFU/mL）
5-羟甲基糠醛脱落量/（μg/mL）pH3.0
90.0±13.5
粒径在45.0μm165.0μm范围内试样颗粒的体积与全部试样颗粒体积之比。在0.10MPa压力下可达最高流速。b
每毫升介质对Ni+的螯合量。
每毫升介质对乳酸脱氢酶（His-taggedLDH)的吸附量。6检测方法
6.1外观
样品处理
按照GB/T5475直接从产品中抽取5mL样品，置于50mLG3型号砂芯漏斗中抽干5min。用符合GB/T6682的三级水清洗5次，每次2min，最后用真空泵在0.1MPa压力下抽干5min。将洗净的金属螯合层析介质置于烧杯中，向其中补加三级水，保证金属螯合层析介质上应有2cm的三级水。混匀后得到金属螯合层析介质与水的混合体系。6.1.2样品观测
用塑料吸管吸取混合体系置于载玻片上，调整显微镜放大倍数。以视野里80%以上面积均为金属螯合层析介质为标准，用塑料吸管增减载玻片上的金属螯合层析介质，最后用盖玻片压上。调节光学显微镜焦距，使视野中的影像清晰。拍摄金属螯合层析介质照片并保存。2粒径
样品处理
方法同6.1.1。
样品检测
设置激光粒度仪参数如下：测量颗粒类型为通用型，分散剂类型为水，分析模式为单峰模式，添加样品进行测定。
6.2.3结果计算
范围粒径比
按式(1)计算：
式中：
W教径
W教控
范围粒径比，%；
粒径为k（um)颗粒的体积与全部试样颗粒体积之比，%。平均粒径
按式(2)计算：
式中：
一所统计的一定数量介质颗粒的平均粒径，单位为微米（μum）；单个颗粒的粒径，单位为微米（um）；N—所统计的介质颗粒的数目。
GB/T38171—2019
（1）
（2）
在重复性条件下获得的三次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。6.3最高流速
样品处理
方法同6.1.1。
6.3.2样品装柱
选用?1.60cm×20.00cm的层析柱，堵住柱子出口，将介质与水的混合浆液倒人层析柱中，静置。控制介质床层高度为10.00cm士0.20cm，柱子上端充满水。打开柱子人口，以0.5mL/min的流速连续向柱中通入10个柱体积的三级水，床层稳定后即可进行测试。6.3.3样品测定
将层析柱连人中低压层析系统。测定时，从零开始设定一定流速u（mL/min），保持该流速5min后，记录此时柱压p（MPa）。继续增加流速，并测定相应流速下的柱压。直到压力达到0.10MPa为止，此时对应流速记录为Uo.1。6.3.4结果计算
按式（3)计算：
最高流速，单位为厘米每小时（cm/h）；在0.10MPa压力下的体积流速，单位为毫升每分（mL/min）；（3)
GB/T38171—2019
一层析柱截面积，单位为平方厘米（cm）：60
分钟转化为小时的换算系数。
在重复性条件下获得的三次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。6.4配基密度
6.4.1溶液配制
氨-氯化铵缓冲液甲，pH10.0
将氯化铵68.00g溶于300mL三级水中，加浓氨水570mL，用三级水稀释，调pH为10.0，最后定容至1000mL。
6.4.1.2氨-氯化铵缓冲液乙·pH10.0称取氯化铵5.40g，加三级水50mL溶解后，加35mL浓氨水，用三级水稀释，调pH为10.0，最后定容至100mL。
6.4.1.35g/L铬黑T指示液
称取0.50g铬黑T加盐酸羟胺4.00g溶于100mL乙醇中。6.4.1.4紫脲酸胺指示剂
称取紫腺酸胺1.00g，加氯化钠100.00g于研钵内研成粉状，装入棕色干净的广口瓶中备用。6.4.1.50.10mol/L乙二胺四乙酸二钠（简称EDTA标准溶液）称取40.00g乙二胺四乙酸二钠，溶于1000mL三级水中，冷却，摇匀。6.4.1.60.10mol/LEDTA标准溶液的标定称取0.2500g于800C灼烧至恒重的基准氧化锌，称准至0.0001g。用少量三级水湿润，加5mL20%的盐酸溶液使样品溶解.加10mL三级水，用10%氨水溶液中和至pH7~8，加10mL氨-氯化铵缓冲液甲（pH10)及5滴5g/L铬黑T指示液，用配制好的EDTA标准溶液滴定至溶液由紫色变为纯蓝色。同时作空白试验。
6.4.1.7EDTA标准溶液浓度计算
按式(4)计算：
CEDTA=(V/-V)×0.08138
式中：
乙三胺四乙酸二钠标准溶液的浓度，单位为摩尔每升（mol/L）：一氧化锌质量，单位为克（g）)；乙二胺四乙酸二钠溶液用量，单位为毫升（mL）；空白试验用乙二胺四乙酸二钠用量，单位为毫升（mL）；0.08138——1.00mL乙二胺四乙酸二钠标准溶液转化为相当质量氧化锌的换算系数。6.4.1.80.05mol/LNi(NO3)2标准溶液称取1.45gNi（NO,）2·6H,O溶于100mL三级水中。4
（4）
6.4.1.90.05mol/LNi(NO3)2标准溶液的标定GB/T38171—2019
准确量取50mL上述配制的Ni（NO，）溶液置于250mL三角瓶中，用氨水调节pH值至7~8，加人50mL氨-氯化铵缓冲液乙，0.25g紫脲酸胺指示剂，用0.1mol/L的EDTA标准溶液进行滴定至溶液由黄色变为紫色为终点。记录所消耗的EDTA标准溶液的体积VeDTA.a。6.4.2样品处理
按照GB/T5475直接从产品中抽取5mL样品，置于50mLG3型号砂芯漏斗中。用三级水清洗5次，每次2min，再用0.1mol/LEDTA溶液清洗5次，每次5min，将介质上螯合的金属离子清洗净，最后用三级水清洗5次，每次2min，真空泵在0.1MPa压力下抽干5min。6.4.3样品装柱
称取2.00g抽干的介质，将其与水的混合浆液倒入层析柱中，堵住柱子出口，静置，待柱床层稳定。打开柱子人口，连续向柱中通入三级水（10个柱体积），保持床层稳定。6.4.4样品测定
准确量取50mLNi（NO）z标准溶液，匀速通过柱内，立即收集流出液；再用50mL三级水洗涤，同时收集流出液，将所有收集的流出液混合。上述收集的Ni（NO：）。流出液用氨水调节pH值至7～8，加人50mL氨-氯化铵缓冲液乙，0.25g紫脲酸胺指示剂，用0.1mol/L的EDTA标准溶液进行滴定至溶液由黄色变为紫色为终点。记录所消耗的EDTA标准溶液的体积VEDTA.1。6.4.5结果计算
根据式(5)计算：
式中：
VEDTA-I
PNet Ema VeVA 1 00
金属螯合层析介质配基密度，单位为微摩尔每毫升（umol/mL）：EDTA标准溶液浓度，单位为摩尔每升（mol/L）；Ni（NO：）2标准溶液消耗EDTA标准溶液体积，单位为毫升（mL）；收集到的Ni(NO)流出液消耗EDTA标准溶液体积.单位为毫米（mL)；金属螯合层析介质质量，单位为克（g）；金属螯合层析介质质量转化为体积的换算系数。在重复性条件下获得的三次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。6.5动态载量
6.5.1溶液配制
6.5.1.1缓冲液A.pH7.4
.（5)
准确称取5.80gNazHPO,·12H,O、0.59gNaH,PO,·2HzO.5.84gNaCI和3.40g咪唑.用三级水溶解，调节pH至7.4.再定容至1000mL.最后用0.45μm孔径的滤膜过滤。6.5.1.2缓冲液B.pH7.4
准确称取2.90gNa2HPO4·12H2O、0.29gNaHPO4.2H2O、2.92gNaC1和17.02g咪唑，用三5
GB/T38171—2019
级水溶解，调节pH至7.4，再定容至500mL，最后用0.45um孔径的滤膜过滤6.5.1.3His-taggedLDH样品（纯度>95%）称取300.0mgHis-taggedLDH冻干粉（用二级水透析后冻干，纯度>95%），溶解于100mL缓冲液A中，浓度为3.0mg/mL，按照《中华人民共和国药典》（2015年版）（0731）考马斯亮蓝法标定蛋白浓度.再用0.45um孔径的滤膜过滤
6.5.1.41%（体积分数）丙酮溶液准确量取0.1mL丙酮，加三级水混合，定容至10mL。6.5.2样品处理
方法同6.1.1。
6.5.3样品装柱
选用Φ1.60cm×20.00cm的层析柱，堵住柱子出口，将介质与水的混合浆液倒入层析柱中，静置，控制介质床层高度为5.00cm土0.20cm，柱子上端充满水。打开柱子入口，以2.0mL/min的流速连续向柱中通人10个柱体积的三级水，床层稳定后即可进行测试。6.5.4样品测定
将层析柱连在层析系统中，并检测280nm处紫外线（UV)信号，对载量测定过程进行监控动态结合载量用50%穿透值表示。测量并记录样品His-taggedLDH的100%UV信号，包括不结合到介质上的His-taggedLDH的紫外吸收。用缓冲液A以2.0mL/min流速平衡层析柱至紫外基线平衡，以2.0mL/min流速上样，待流穿曲线中His-taggedLDH的UV信号浓度为50%的样品浓度时上样结束，记录上样体积。上样结束后用缓冲液A以2.0mL/min的流速平衡紫外信号至基线：用缓冲液B以2.0mL/min的流速进行洗脱。计算动态载量。非保留条件下穿透体积测定：将层析柱连在层析系统中，并检测280nm处UV信号，上样10μL1%丙酮，记录下出现UV信号最大时对应的体积。6.5.5结果表示
按式（6)计算：
式中：
Q0% - Co(Vi- V)
介质的动态载量，单位为毫克每毫升（mg/mL）；Co
蛋白起始浓度，单位为毫克每毫升（mg/mL）；V
...（6)
一一柱出口蛋白浓度C达到入口蛋白浓度C，的50%时流出液体积，单位为毫升（mL）；V。
—非保留条件下穿透体积，单位为毫升（mL）；Vael
一一介质体积，单位为毫升（mL）。在重复性条件下获得的三次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。6.6菌落总数
样品前处理
方法同6.1.1。
6.6.2样品测定
GB/T38171—2019
参照《中华人民共和国药典》（2015年版）（1105）非无菌产品微生物限度检查—微生物计数法进行。取1mL抽干介质，加入1mL三级水，采用涡旋混合器混勾样品。将含有30mL胰蛋白陈大豆琼脂培养基的锥形瓶121.0℃灭菌20min，放入40.0℃恒温箱中，待培养基冷却到40.0℃时.用微量移液器吸取1mL混匀后的样品加人该锥形瓶中，混勾，把混合物倒入培养Ⅲ中，盖好上盖。在室温下使混合物凝固。把培养血置于恒温箱中35.0℃孵育5d。6.6.3结果计算
孵育期后检查培养Ⅲ。计数菌落形成单位数（CFU）。在重复性条件下获得的三次独立测定结果的不得超过5CFU/mL悬浮液。6.75-羟甲基糠醛脱落量
6.7.1溶液配制
6.7.1.110%（体积分数）甲醇水溶液准确量取100mL色谱纯无水甲醇，与900mL二级水混合均匀，再用0.22μm孔径的滤膜过滤，超声除气泡。
6.7.1.25-羟甲基糠醛标准储备溶液准确称取20.0mg5-羟甲基糠醛标准物质于100mL容量瓶，用10mL10%甲醇水溶液溶解，定容，配成0.20mg/mL的标准储备液。6.7.1.31mmol/L盐酸溶液.pH3.0量取0.083mL浓盐酸（12mol/L）稀释定容为1000mL，调节pH为3.0。6.7.1.4100mmol/L氢氧化钠溶液·pH13.0准确称取4.00g氢氧化钠固体，溶于100mL三级水中，待冷却至室温后用三级水定容为1000mL，调节pH为13.0。
6.7.1.5标准工作溶液
分别吸取5-羟甲基糠醛标准储备溶液5μL、15μL、25μL、40μL、50μL、100μL、1mL、2mL至100mL容量瓶中，用10%甲醇水溶液稀释至刻度，配成0.01μg/mL、0.03μg/mL、0.05μg/mL、0.08μg/mL、0.10μg/mL、0.20μg/mL、1.00μg/mL、2.00μg/mL标准工作溶液。现配现用。6.7.2样品处理
清洗方法同6.1.1。然后取若干份1.00g抽干金属螯合层析介质置于带盖玻璃试管内。分别取10mLpH3.0和pH13.0的溶液置于各试管内。样品管在40.0℃条件下培养。7d后，将上层清液转移到干净的试管内。
上层清液经旋转蒸发（60.0℃，50r/min）.定容至2mL，加人等体积12mol/L盐酸，100.0℃水解1h。定容至5mL。用0.45μm滤膜过滤，得到样品待测液。6.7.3样品测定
高效液相色谱条件：色谱柱选择Ci8，5um，250mmX4.6mm（内径）。流动相是10%甲醇水溶液。GB/T38171—2019
流速1.0mL/min。检测波长285nm。柱温30.0℃。进样量10μL。以上述高效液相色谱条件对标准工作溶液和样品待测液进行检测。记录标准工作溶液的保留时间以及峰面积，以峰面积对相应浓度绘制标准工作曲线。以标准工作溶液的保留时间对样品进行定性，并记录下该保留时间处峰的面积，用标准工作曲线对样品进行定量6.7.4结果计算
按式(7)计算：
式中：
X——每毫升介质中5-羟甲基糠醛的脱落量，单位为微克每毫升（μg/mL)；C
-从工作曲线求得的试样溶液中5-羟甲基糠醛的浓度，单位为微克每毫升（μg/mL)；V
试样经盐酸水解后最终的定容体积，单位为毫升（mL）；称取的金属螯合层析介质的质量，单位为克（g）；1.4一一金属螯合层析介质质量转化为体积的换算系数在重复性条件下获得的三次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。7检验规则
7.1组批
同一工艺周期生产，质量均一的产品为一批。7.2
按GB/T5475的规定进行。
出厂检验
·（7）
每批产品出厂前应进行检验，检验合格的产品方可出厂。出厂检验项目为第5章中规定的粒径、最高流速、配基密度、动态载量和菌落总数。7.4
型式检验
正常生产时，每半年应进行一次型式检验，有下列情况之一时应进行型式检验：7.4.1
a）新产品试制鉴定时；
正常生产后，如原料、工艺、设备有较大变化，可能影响产品性能时；产品停产半年以上恢复生产时；c）
出厂检验结果与上次型式检验有较大差异时；d)
监督机构提出要求时。
7.4.2型式检验项目为第5章中规定的所有项目7.5免费标准bzxz.net
判定规则
出厂检验判定和复检
出厂检验项目符合7.3中项目要求，判定本批为合格品7.5.1.1
出厂检验项目1～2项不符合要求，应复检，复检后如仍有1项不符合要求，则判定该批为不合格品。
出厂检验项目超过2项不符合要求，判定该批产品为不合格品。7.5.1.3
型式检验判定和复检
型式检验项目符合7.4中项目要求，判为合格品GB/T38171—2019
型式检验项目1～3项（含3项）不符合要求，应复检，复检后如仍有1项不符合要求，则判定该批为不合格品。
型式检验项目超过3项不符合要求，判定该批产品为不合格品。标签、标志、包装、运输和购存8.1
应至少包括以下内容：
产品名称；
型号；
体积；
生产批号；
生产组织；
生产日期；
有效期；
注意事项。
包装储运标识应符合GB/T191的规定8.3包装
宜选用塑料瓶包装，包装材料应确保产品在运输、贮存时不被污染和泄漏。8.4运输
应在常温环境下运输，避免过冷或过热，且采取措施防止产品失水。5购存
应在4℃～8℃环境下贮存，有效期为五年，超过有效期可按本标准规定进行复验，若复验结果符合标准要求，仍可使用。
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