GB/T 40252-2021.Viability test of Monilinia fruticola (G. Winter) Honey.
1范围
GB/T 40252描述了应用普通荧光显微镜或激光扫描共聚焦显微镜对美澳型核果褐腐病菌[Moniliniafruticola (G. Winter) Honey]进行活性检测的方法。
GB/T 40252适用于美澳型核果褐腐病菌相关寄主中携带美澳型核果褐腐病菌的分生孢子活性检测。
2规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
SN/T 2589植物病原真菌检测规范.
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1
活性 viability
具有生命力的一-种性质。
3.2
分生孢子活性 conidial viablity
分生孢子具有生命力的一种性质。
注:分生孢子具有活性,说明分生孢子是活的;分生孢子不具有活性,说明分生孢子是死的。
4基本信息
中文名:美澳型核果褐腐病菌
英文名:pathogen of American brown rot of stone fruit
学名:Monilinia fructicola (G. Winter) Honey
曾用名:Sclerotinia fructicola ( Winter) Rehm
无性态:Monilia fructicola Batra
分类地位:属真菌界(Fungi),子囊菌门(Ascomycota)子囊菌纲( Ascomycetes)，柔膜菌目( Helotiales) ,核盘菌科( Sclerotiniaceae) ,链核盘菌属(Monilinia)。
美澳型核果褐腐病菌寄主、症状、菌落特征及分生孢子形态学特征见附录A。
本文件描述了应用普通荧光显微镜或激光扫描共聚焦显微镜对美澳型核果褐腐病菌［Moniliniafruticola(G.Winter) Honey］进行活性检测的方法。本文件适用于美澳型核果褐腐病菌相关寄主中携带美澳型核果褐腐病菌的分生孢子活性检测。

ICS65.020.01
CCS B16
中华人民共和国国家标准
GB/T40252—2021
美澳型核果褐腐病菌活性检测方法Viability test of Monilinia fruticola (G.Winter) Honey2021-05-21发布
国家市场监督管理总局
国家标准化管理委员会
2021-12-01实施
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GB/T40252—2021
本文件按照GB/T1.12020标准化工作导则」第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草，
请注意本文件的某些内容可能涉及专利：本文件的发布机构不承担识别专利的责任本文件由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271)提出并归口。本文件起草单位：中华人民共和国深圳海关、深圳市检验检疫科学研究院、深圳市仙湖植物园，本文件主要起草人：章佳明、工颖、高瑞芳、程颖慧、朱了饮、李娜、黄河清、刘荣。rrKaeerkAca-
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1范围
美澳型核果褐腐病菌活性检测方法GB/T40252—2021
本文件描述了应用普通荧光显微镜或激光扫描共聚焦显微镜对关澳型核果褐腐病菌［Mnniliniafruticolu（G.Witer）Honey进行活性检测的方法：本文件适用于关澳型核果祸腐病茵科关寄主巾携带美澳型核果褐腐病菌的分牛孢子活性检测2规范性引用文件
下列文件巾的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款，其中，注日期的孔用文件，仅该日期对应的版不适用丁不文件：不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修收单）适用丁本文件.
SN/T2589植物病原真菌检测规范3术语和定义
下列术语和定义适用丁本文件。3.1
viability
具有生命力的一种性质。
Econidialviablity
分生孢子活性
分生孢了具有生命力的一种性质。注：分牛孢了具有活性，说明分牛孢广是活的：分牛孢了不具有活性，说明分牛孢了是死的4基本信息
中文名：关澳型核果褐腐病菌
英文名：pathogen of American brown rot of stonefruit学名：Moniliniafructicola （G.Winter）Honcy曾用名:Sclerotinia fruclicolu（Winter）Rehm无性态MoniliafructicolaBatra分类地位：属真菌界（Fungi），了囊菌门（Ascomycota）了囊菌纲（Ascomycctcs），朵膜菌月（Helotiales）.核盘菌科（Sclerotiniaceae).链核盘菌属（Monitinia）。美澳型核果褐腐病菌寄主、症状、菌落特征及分生孢子形态学特征见附录A，5原理
分别应用一乙酸荧光素（Flourcsceiniacctatc.FA）和碘化丙啶（Propidiumlodide，Pl荧光染料1
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GB/T40252—2021
对关澳型核果祸腐病菌孢子进行染色处理，根据FDA可通过细胞代谢留在活细胞内，使具有活性的孢了发出绿色荧光，如果细胞膜损伤，则荧光素流失，因而使不具有活性的孢了不发出荧光；PI能够穿透正在死亡或名已经死亡的细胞膜，使不具活性的孢了发出红色荧光，PI不能透过具有活力的细胞膜，使具有活性的孢子不发山荧光。根据上述特点并运用普通灭光显微镜或激光扫描共聚焦显微镜对病菌分生孢子行活性检测.分析分生孢子的死活6仪器和试剂
仪器用具
普通荧光显微镜或激光描共聚焦显微镜、超净级工作台、大平、高压火菌锅、生化培养箱、冰箱、离心机。
6.2试剂
二乙酸荧光索（FlouresceinDiacctatc,FDA）：称取0.1gFDA粉末，加人10ml.丙酮，配制成浓度为10mg·mL-的母液.置丁棕色瓶4℃避光保存。使用前用内酮稀释，配置成0.5mgmL-的工作液。
碘化内啶（PropidliumIodide.PI)：称取0.01gPI粉木，加人10mL无茵水，配制成浓度为1mg·mL的母液.置于棕色瓶1℃避光保存，使用前用无菌水稀释，配置成0.05mg·ml.的工作液。6.3主要培养基
马铃薯葡菊糖琼脂培养基（PDA）：200g去皮马铃薯切成小方块，加人1000mL白来水，点沸15min.用四层纱布过滤得到滤液，滤液巾川入18g葡菊糖、18g琼脂粉，川热溶解后将溶液定容至」000ml..分装到三角瓶中.12l“高压蒸汽灭菌20min7活性检测方法
7.1检测样品制备
刮取寄主症状病征的分牛孢子装入到有无菌水的离心替巾，配制成终浓度为每微升含10个100个孢子的孢子态浮液.镜检，备用7.2孢子染色
7.2.1FDA染色
取199L孢了悬浮液，加人1μL质量浓度为0.5mg·mL-的FDA，混勾，丁室温下光染色15min.16000g离心1min，充上清液终止染色，加入火菌去离子水洗涤一次，重新悬浮。现配现用，避光放置。
7.2.2PI染色
取199μl孢子志浮液·川入1μL质量浓度为0.05 mg·mL的PI混勾，于室温下避光染色4min，16 000g离心【min弃1清液终止染色加灭菌去离了水洗涤一次，重新恩浮，现配现用.避光放置。
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7.3普通荧光显微镜或激光扫描共聚焦显微镜活性检测7.3.1普通荧光显微镜检测
7.3.1.1制片
吸取5μL活性染料处埋之后的样品制备玻片·封片。7.3.1.2检测
GB/T 40252—2021
将制好的被片立即放置于普通荧光显微镜载物台上，在低倍镜下找到孢子，然后转至40倍镜下观察，微调至视野内图像清晰下观察并计数。至少检测30个孢子，观察染色情况，FA染色检测：将费光光路打升，设置费光通道的激发波长488nm·收集灭光信号的发射波长530nm，收集荧光信号：微调至视野内图像清晰：（见附录B）PI染色检测：将荧光光路打开.设置炎光通道的激发波长534nm，收集荧光信号的发射波长617nm，收集荧光信号。微调至视野内图像清晰。（见附录B）注：为了保证图像能够反映出孢子最真实的荧光染色情况，特别需要观察明场通道下所得到抱子图像是否清晰，7.3.2激光扫描共聚焦显微镜活性检测7.3.2.1制片
吸取5.活性染料处理之后的样品制备玻片，封片。7.3.2.2激光设置
选择相应的激光管（氩离了激光器）激发荧光信号，FID)A检测设置荧光通道的激发波长（488nm），收集荧光信号的发射波长（530nm），并设置个明场通道作为对照，PI检测设置荧光通道的激发波长（534nm），收集荧光信号的发射波长（617nm），并设置个明场通道作为对照。7.3.2.3扫描设置
选择低像素扫描模式扫描（xy：512×512），重复扫描次数Avtragc为1次，扫描速度Spccd为9，根据成像效果调整探测针孔Pinhole、光电倍增管增益Gain和激光扫描强度Scan Str等参数，将图像调整至质量较好的效果。再用精确扣描方式（xy:2018×2018)然后根据信噪比调整扫描模式.选择精确像素的平而扫描方式进行粗略扫描（xy：2018×2048），重复扫描次数Avcragc为2次.扫描速度Spccdl为6，获取最终图像。
7.3.2.4检测
将制好的破片立即放置于激光扫描共聚焦显微镜载物台1，低倍镜下找到孢了，转到40倍镜下观察，微调至视野内图像清晰·扫描至少30个孢了.观察染色结果。（见附录（）注：为广保证图像能够反呗出孢子最真实的炭光染色情况.特别需要现察助场通道下所得到孢子图像是否洁晰。8结果判断与表述
通过普通炭光显微镜或激光共聚焦显微镜抖描检测分别经FDA和PI处理至少30个分生孢子，结果判断与表述如下：
如经FIA处理检测到分生孢了发绿色荧光，以及经PI处理检测到分生孢了不发荧光，则判定该分生孢子具有活性；
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如经PI处理检测到分牛孢子发红色荧光，以及经FDA处理检测到分生孢子不发荧光.则判定该分生孢了不具有活性。
样品与原始数据集保存
9.1样品保存
存否样品成视样品的状态采用相成的保存方式，要善保存6个片：如发现具有活性的关澳型核果祸腐病图范子的，进行斜而保存·如沙皮贸易纠纷则成保存到纠纷解决完毕，保存期满片·需经灭菌处理。样品保存方法应符合SV/I2589的规定。9.2
原始数据保存
样品检测结束后，其原始记录单和检验结果或证书应归档，妥菩保管，以备复验、谈判和仲裁rrKaeerkAca-
A.1主要寄主
附录A
（资料性）bZxz.net
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美澳型核果褐腐病菌寄主、症状、菌落特征及分生孢子形态学特征主要寄主有苹果（Malusdomestica），番木瓜（Caricapupaya），欧李（CerasusHumilis），樱桃（Cerususpseudocerasus），欧洲山茱英（Cornusmas），杏（Prunus armeniacu），欧洲柑樱桃（Prunusauium）欧洲酸樱桃（PrunusCerasus）欧洲李（Prunus domestica），扁桃（Prunus dulcis）桃（Prunuspersica）李（Prunussaticina），杏李（Prunussimonii），葡箭（Vitisuinifera），枇杷（EriobotryaJaponica）.病菌还可在木瓜属（Chaenomeles）、山楂属（Crataegus）、槛柠属（Cvdonia）、枇杷属（Eriohorrya）、刚竹属（Phvllostachvs）、李属（Prunus）、梨属（Pyrus）等寄主l为害。A.2为害症状
该病害主要为害果实，病害发牛初期果实衣而上形成灰褐色圆形病斑，随后病斑迅速蔻延扩展至全果，并使果肉变褐软腐，病部表面产生散生的灰褐色绒球状层，最后病果大部分或完全腐烂脱落或十缩成偶果恩挂枝条「经久不落，若在低湿度条件下，整个果实皱缩.干瘩。受侵染的花和叶变褐，情萎。形成一个典型的枯萎状，作茎上造成褐色的凹陷区域（溃疡斑），通常其衣面聚集着树胶。潮湿条件下，在这些受侵染的组织上产生分生孢子梗束，关澳型核果褐腐病菌为害症状见图A.1.a）美澳型核果褐腐病在苹果上症状b）美澳型核果褐腐病在李上症状c）美澳型核果褐腐病在桃上症状图A.1美澳型核果褐腐病菌为害症状图A.3：菌落特征
菌落牛长速度快在PDA培养基上22℃培养8d左右·菌落可布满整个培养ⅢL，呈同心轮纹状.菌落边缘完整，质地均勾气牛茵丝巾等发达、呈绒球状.茵落颜色初期灰门，后期呈灰黄色或灰祸色、产袍量丰富、菌落表而的分生孢了堆呈同心轮纹圆环，菌株在PDA培养基上生长菌落形态见图A.25
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A.4分生孢子形态学特征
菌株在PDA上生长菌落形态
孢子链呈念珠状，柠檬形至椭圆形，有时顶部半截.大小为（8um28um）×（5μm~19pm），无色透明,聚集时为灰黄色。分生孢了梗较短分枝或不分枝，顶端申生分生孢了，6
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附录B
（资料性）
普通荧光显微镜对美澳型核果褐腐病菌孢子染色观察结果图普通荧光显微镜观察FDA对美澳型核果祸腐病茵孢子染色效果见图B.110μm
标引序号说明：
A,B——活孢了染色结果、A为荧光通道，B为明场：（D）一一死孢了染色果，为火光迎道，D)为明场GB/T40252—2021
普通荧光显微镜观察 FDA 对美澳型核果褐腐病菌孢子染色效果图图B.1
普通荧光显微镜观察PI对美澳型核果褐腐病菌孢子染色效果见图B.2。-riKaeerka
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标引序号说明：
死孢子染色结果，A为荧光通道，B为明场：A. B
活孢子染色结果，C为荧光通道，D为明场。图B.2
普通荧光显微镜观察以对美澳型核果褐腐病菌孢子染色效果图-rKaeerkca-
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