GB/T 18644-2020.Diagnostic techniques for porcine cysticercosis.
1范围
GB/T 18644规定了猪囊尾蚴病的显微镜检查、聚合酶链式反应法(PCR法)、间接酶联免疫吸附试验(间接ELISA)、斑点生物素-亲和素复合物酶联免疫吸附试验(Dot-ABC-ELISA)诊断技术及综合判定。
GB/T 18644适用于猪和野猪的囊尾蚴病诊断。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
CNAS-GL029:2018基因扩增领域检测实验室认可指南
3缩略语
下列缩略语适用于本文件。
Avidin-HRP :亲和素辣根过氧化物酶( Avidin-Horseradish Peroxidase)
DAB:二氨基联苯胺(3, 3'-Diaminobenzidine)
Dot-ABC-ELISA:斑点生物素-亲和素复合物酶联免疫吸附试验( Dot-Avidin-Biotin-Complex-ELISA)
ELISA:酶联免疫吸附试验( Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)
HRP :辣根过氧化物酶( Horse Radish Peroxidase)
IPTG:异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropyl β-D-Thiogalactoside)
NC:硝酸纤维素(Nierocellulose)
OPD:邻苯二胺(O-phenylenediamine)
PBS:磷酸盐缓冲液( Phosphate Buffered Saline)
PBST :洗涤液(PBS containing 0.5% Tween-20)
PCR:聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)
TMB:四甲基联苯胺(3,3' ,5,5'-Tetramethyl Benzidine)

ICS11.220
中华人民共和国国家标准
GB/T18644—2020
代替GB/T18644—2002
猪囊尾呦病诊断技术
Diagnostic techniques for porcine cysticercosis2020-12-14发布
国家市场监督管理总局
国家标准化管理委员会
2020-12-14实施
规范性引用文件
缩略语
显微镜检查
仪器设备
虫体采集
压片制备
显微镜检查
显微镜检查结果判定
PCR法
仪器设备
PCR操作程序
扩增产物电泳检测
试验成立条件
PCR结果判定
间接ELISA
仪器设备
试验步骤
试验成立条件
ELISA结果判定
Dot-ABC-ELISA
仪器设备
试验步骤
试验成立条件
Dot-ABC-ELISA结果判定
综合判定
GB/T18644—2020
GB/T18644—2020
附录A（规范性附录）
附录B（规范性附录）
附录C（规范性附录）
附录D（资料性附录）
附录E（资料性附录）
附录F（资料性附录）
附录G（资料性附录）
生理盐水及猪囊尾坳头节形态特征PCR引物位置、溶液配制及电泳结果ELISA试剂及其配制.
猪囊尾蝴TS-CC18重组蛋白的制备间接酶联免疫吸附试验的加样
猪囊尾蜘TS-CC18和烯醇化酶单克隆抗体的制备Dot-ABC-ELISA相关试剂配制及结果判定........
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。GB/T18644—2020
本标准代替GB/T18644—2002《猪囊尾坳病诊断技术》，与GB/T18644—2002相比，除编辑性修改外，主要技术变化如下：
一范围部分增加了PCR和Dot-ABC-ELISA技术（见第1章）：增加了缩略语部分（见第3章）；增加了病原的PCR检测方法（见第5章）；修改了酶联免疫吸附试验的检测抗原和检测步骤，直接对血清样品进行抗体检测（见第6章，2002年版的第3章）；
一增加了检测循环抗原的Dot-ABC-ELISA方法（见第7章）；增加了综合判定（见第8章）；
增加了生理盐水及猪囊尾蝴头节图片（见附录A）,PCR引物位置、溶液配制及电泳图片（见附录B)ELISA试剂及其配制（见附录C,2002年版的附录A），猪囊尾蝴TS-CC18重组蛋白的制备（见附录D），间接酶联免疫吸附试验加样示例（见附录E），猪囊尾坳TS-CC18和烯醇化酶单克隆抗体的制备（见附录F),Dot-ABC-ELISA相关试剂配制及结果判定（见附录G)。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由中华人民共和国农业农村部提出。本标准由全国动物卫生标准化技术委员会（SAC/TC181)归口。本标准起草单位：中国农业科学院兰州兽医研究所。本标准主要起草人：才学鹏、骆学农、张少华、郑亚东、郭爱疆、侯俊玲。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：GB/T18644—2002。
GB/T186442020
猪囊尾坳病（porcinecysticercosis）是由猪带终虫（Taeniasolium）的幼虫所引起的一种危害严重的人兽共患寄生虫病。世界动物卫生组织将该病列为需申报的疾病之一。目前，该病广泛存在于发展中国家，而且发达国家的病例也有逐年增加的趋势，不仅影响养猪业的发展，造成巨大的经济损失，而且还严重威胁人类健康。
猪囊尾坳病的诊断包括病原学诊断与血清学诊断。病原学诊断的目的在于确定临床剖检样本中虫体的形态特征，在显微镜下观察头节顶突上有内外两圈排列整齐的小钩，即可判为猪囊尾。若囊尾蚜主要寄生于肝脏，则要注意与亚洲带缘虫囊尾坳相区别。目前，该病的生前诊断主要采用血清学方法，所用的抗原有虫体抗原、囊液抗原或分泌代谢抗原等，虽然这些抗原的检测敏感性较高，但特异性差，而且抗原来源非常有限。鉴于以上原因，本次对GB/T18644一2002《猪囊尾病诊断技术》的修订，除间接ELISA所用抗原改为猪囊尾蝴期特异性18ku基因（TS-CC18)重组蛋白外，还增加了血清循环抗原(CAg)检测方法和病原的PCR检测方法，以满足猪囊尾蜘病流行病学调查、药物治疗效果评价和动物流通风险评估等不同需求。
本文件的发布机构提请注意，声明符合本文件时，可能涉及到第6章间接酶联免疫吸附试验（ELISA)相关的专利使用。
本文件的发布机构对于该专利的真实性、有效性和范围无任何立场该专利持有人已向本文件的发布机构保证，他愿意同任何申请人在合理且无歧视的条款和条件下，就专利授权许可进行谈判。该专利持有人的声明已在本文件的发布机构备案。相关信息可以通过以下联系方式获得：
专利持有人姓名：才学鹏、张少华、景志忠、骆学农、郭爱疆、郑亚东、窦永喜地址：甘肃省兰州市盐场堡徐家坪1号。请注意除上述专利外，本文件的某些内容仍可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。
1范围
猪囊尾呦病诊断技术
GB/T18644—2020
本标准规定了猪囊尾坳病的显微镜检查、聚合酶链式反应法（PCR法）、间接酶联免疫吸附试验（间接ELISA）、斑点生物素-亲和素复合物酶联免疫吸附试验（Dot-ABC-ELISA)诊断技术及综合判定。本标准适用于猪和野猪的囊尾蚜病诊断。规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。CNAS-GL029：2018基因扩增领域检测实验室认可指南缩略语
下列缩略语适用于本文件
Avidin-HRP：亲和素-辣根过氧化物酶（Avidin-HorseradishPeroxidase）DAB：二氨基联苯胺（3，3-Diaminobenzidine）Dot-ABC-ELISA：斑点生物素-亲和素复合物酶联免疫吸附试验（Dot-Avidin-Biotin-ComplexELISA)
ELISA：酶联免疫吸附试验（Enzyme-LinkedImmunosorbentAssay）HRP：辣根过氧化物酶（HorseRadishPeroxidase）IPTG：异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（Isopropylβ-D-Thiogalactoside）NC：硝酸纤维素（Nicrocellulose）OPD：邻苯二胺（O-phenylenediamine）PBS：磷酸盐缓冲液（PhosphateBufferedSaline）PBST：洗涤液（PBScontaining0.5%Tween-20)PCR：聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction）TMB：四甲基联苯胺（3.3°.5，5-TetramethylBenzidine）4显微镜检查
4.1试剂
生理盐水配制见附录A中的A.1。4.2
仪器设备
4.2.1正置生物显微镜
4.2.2手术剪、手术刀、镊子。
载玻片。
GB/T18644—2020
4.2.4微量可调移液器（量程为20μL～200μL）。4.3虫体采集
肉眼观察舌肌、咬肌、内腰肌、膈肌、肩脚肌及心脏、肝脏、肺脏等组织，采集有可疑虫体寄生部位的肌肉或内脏组织，用手术刀将其切成约1cm厚的薄片，仔细检查切口有无虫体。成熟的猪囊尾蜘为长椭圆形，大小为（6mm~10mm）×5mm，半透明，囊内充满液体，上有一栗粒大小的白色头节。脑内寄生的则为圆球形，直径8mm～10mm。以手术刀和镊子剥离肌肉等组织中的囊尾蜘，用生理盐水洗净。
4.4压片制备
以手术剪剪开囊壁，取出完整的头节，以滤纸吸干囊液后，将其置于两张载玻片之间并压片。5显微镜检查
将压片置于低倍显微镜（4Q×）下，仔细观察虫体头节的形态和特征。6显微镜检查结果判定
如虫体头节的顶部有顶突，顶突上有内外两圈整齐排列的小钩，顶突的稍下方有四个均等的圆盘状吸盘（见图A1），即判为猪囊尾蜘；如顶突无小钩则判为亚洲带终虫囊尾坳。猪囊尾蜘虫体应于-20℃或-70℃冰箱冻存。
5PCR法
5.1试剂
PCR试剂
5.1.1.110XPCR缓冲液。
dNTP预混液（2.5mmol/L）。
5.1.1.3 MgClz(25 mmol/L)。
5.1.1.4 Ex Taq酶(5 U/μL)。
电泳试剂
5.1.2.1电泳缓冲液：50XTAE贮存液（见附录B中的B.2.1)，临用时加蒸馏水配成1×TAE缓冲液（见B.2.2）。
5.1.2.2琼脂糖：核酸电泳用琼脂糖。5.1.2.3电泳加样缓冲液：见B.2.3。5.1.2.4
DNAMarker（DNA标志物）：条带大小依次为100bp、250bp、500bp、750bp、1000bp和2000bp。
仪器设备
PCR扩增仪。
5.2.2台式低温高速离心机。
稳压稳流电泳仪和水平电泳槽。5.2.4Www.bzxZ.net
凝胶成像仪（或紫外透射仪）。2
GB/T18644—2020
5.2.5微量可调移液器（量程为0.1μL~2.5μL0.5μ~10μL、10μL~200μL、100μL～1000μL）。5.2.6无核酸酶的离心管与吸头。5.2.7PCR扩增管。
5.3引物
5.3.1上游、下游引物序列
根据猪带终虫线粒体ND1部分序列设计如下引物：上游引物:5'-CTAGGCCACTTAGTAGTTTAGTTA-3'；下游引物：5'-CATAAAACACTCAAACCTTATAGA-3。PCR扩增片段的核苷酸序列及引物的位置见B.1。5.3.2引物储存液
用去离子水将每条引物配成100μmol/L的储存液，置于一20℃冻存5.3.3引物工作液
将上游、下游引物分别加去离子水配置为10μmol/L的引物工作液5.4样品
5.4.1猪囊尾坳虫体的采集，方法同4.3。5.4.2阳性对照：用猪囊尾虫体提取的DNA。5.4.3阴性对照：依据虫体采集部位，用未感染猪肌肉或肝脏提取的DNA。5.5PCR操作程序
5.5.1DNA提取
用DNA提取试剂盒提取囊尾坳和肌肉的基因组DNA。DNA提取应符合CNAS-GL029:2018基因检测实验室区域的设置原则。5.5.2PCR反应体系
采用50μL反应体系，扩增体系包括：10×PCR反应缓冲液
dNTP(2.5mmol/L)
MgCl2 (25 mmol/L)
上游引物工作液（10μmol/L）
下游引物工作液（10μmol/L）
ExTaq酶(5U/μL)
DNA模板
去离子水
5.5.3扩增程序
将PCR扩增管放入扩增仪中，设定扩增程序：第一阶段，95℃预变性3min；
补足至50uL
第二阶段，95℃变性30s，45℃退火40s，72℃延伸60s，共进行35个循环；3
GB/T18644—2020
一第三阶段.72℃延伸5min
5.6扩增产物电泳检测
5.6.11.2%琼脂糖凝胶的制备：称取1.2g琼脂糖，加人100mL1×TAE缓冲液（见B.2.1和B.2.2）中。加热融化后加5uL质量浓度为10mg/mL的漠化乙锭，混匀后倒人放置于水平台面上的凝胶盘中，胶板厚5mm左右。依据样品数选用适宜的梳子。待凝胶冷却凝固后拔出梳子（胶中形成加样孔），放人电泳槽中.加1×TAE缓冲液浸没胶面约3mm。5.6.2加样：取10uLPCR扩增产物和2L加样缓冲液（见B.2.3）混匀后加人一个加样孔。每次电泳同时设标准DNAMarker、阴性对照和阳性对照5.6.3电泳检测：按5V/cm恒压电泳至溴酚蓝染料距离凝胶底部约1cm时，停止电泳，取出凝胶置于凝胶成像仪下观察。
5.7试验成立条件
阳性对照样品有一条474bp扩增条带，阴性对照无条带或仅有引物二聚体条带（<100bp），则试验成立。
3PCR结果判定
待测样品有一条474bp的扩增条带，可判定该虫种为猪囊尾哟（见图B.1）6间接ELISA
6.1试剂
6.1.1包被抗原：猪囊尾坳TS-CC18重组抗原。由构建的原核表达载体pET-28a（+）-TS-CC18转化大肠杆菌BL21(DE3），筛选高表达菌株进行诱导表达，采用Ni柱亲和层析纯化制备而成。使用时用碳酸盐包被缓冲液（pH9.6)稀释至工作浓度6.1.2阴性对照血清：健康猪血清。采自3月龄非疫区健康猪，剖检确认无猪囊尾感染；猪全血经自然凝结法分离血清。检测时用样品稀释液稀释至工作浓度。6.1.3阳性对照血清：猪高免血清。由TS-CC18纯化抗原免疫健康猪制备，检测时用样品稀释液稀释至工作浓度。
6.1.4酶结合物：兔抗猪IgG-HRP结合物。检测时用样品稀释液稀释至工作浓度6.1.5碳酸盐包被缓冲液：0.05mol/LNazCO/NaHCO，缓冲液（pH9.6），见附录C中的C.1。洗涤缓冲液：含0.5%吐温-20的0.002mol/LPBS（pH7.2~7.4)，见C.2。6.1.6
封闭液1：含0.25%BSA和0.25%酪蛋白等的0.01mol/LPBSpH7.2~7.4），见C.3和C.4。6.1.7
样品稀释液：含0.5%BSA的0.02mol/LPBS(pH7.2~7.4），见C.5和C.6。6.1.9
底物溶液：OPD底物溶液，见C.76.1.10
终止液：2.0mol/L的硫酸溶液，见C.8。6.2仪器设备
台式低温高速离心机。
酶标仪（带450nm、490nm和630nm波长滤光片）。6.2.3
酶标板（96孔）。
6.2.4与96孔酶标板配套使用的振荡器。6.2.5血清稀释板，
6.2.637℃恒温培养箱、湿盒。
6.2.7洗板机或洗涤瓶。
GB/T18644—2020
6.2.8单道可调移液器（量程为0.5μL~10μL、10μL~200μL、100μL~1000μL和1mL~5mL）。多道微量可调移液器（量程为20μL～300μL）。6.2.9
与移液器匹配的各种吸头。
量筒（100mL和2000mL）。
2计时器。
贮液槽。
6.2.14封板膜。
纱布和吸水纸等。
6.3样品
采集猪全血，5mL/头，置4℃析出血清后，3000g离心15min，取上层血清作为待测样品。6.4试验步骤
6.4.1猪囊尾蝴TS-CC18重组抗原制备构建原核表达载体pET-28a（十）-TS-CC18，转化大肠杆菌BL21（DE3），筛选的阳性菌株用终浓度为0.5mmol/L的异丙基硫代半乳糖苷（IPTG)进行诱导表达，获得带6个组氨酸（His）标签的TSCC18重组蛋白；采用NiSepharose6FF亲和层析法进行纯化。TS-CC18重组抗原详细制备及鉴定方法参见附录D。
6.4.2酶标板包被及封闭
将纯化的TS-CC18蛋白按终浓度50ug/mL稀释于pH9.6的碳酸盐包被缓冲液（见C.1)中：每孔100μL加人96孔酶标板，4℃包被过夜。PBST洗板3次后，每孔加120uμL封闭液1（见C.4）于37℃作用2h。PBST洗板3次.在干净纱布或吸收纸市上拍干。经干燥仪充分干燥，用真空包装机密封于铝箔袋中（含干燥剂），贴签，4℃保存备用。6.4.3样品
将待检血清及阴性、阳性对照血清用样品稀释液分别作1：50稀释（294uL样品稀释液加血清6μL），混匀备用。
6.4.4加对照血清和待检血清
参照附录E中的图E.1加样示例图进行加样。ELISA板A1、A2和A3设为空白对照孔，A4、A5和A6加阴性对照血清；H10、H11、H12加阳性对照血清：其余孔加待检血清样品，每份样品横向测3个复孔，每孔100μL，用封板膜封口，37℃孵育60min。6.4.5洗涤
每孔中加300μLPBST，重复洗涤3次后在吸水纸上拍干。6.4.6加酶标抗体
用样品稀释液将免抗猪酶标抗体稀释至工作浓度（1：20000），每孔100uL，封板后同前孵育60min
GB/T18644—2020
6.4.7再洗涤
每孔中加300μL的PBST，重复洗涤4次后在吸水纸上拍于。6.4.8加底物溶液
将分装冻存的OPD于37℃水浴锅中避光溶化，每10mL溶液加人10μL30%H，O，混勾，每孔加100μL，封板，避光37℃孵育15min~20min。6.4.9加终止液和判读结果
每孔加50μL2mol/L的HzSO，终止液，混匀后在分光光度计490nm/630nm下判读结果。试验数据处理
6.4.10.1计算空白对照的平均OD1ga值。6.4.10.2
分别计算阴性和阳性对照血清的平均ODase值。分别计算每份待检血清样品的平均OD490值根据公式(1)计算待检血清与阴性血清平均OD值的比值P/N：P/N=(A-A,)/(A2-A)
式中：
待检血清样品平均OD490值；
A。—空白对照平均OD4go值；
阴性对照血清平均OD4go值。
5试验成立条件
当空白对照平均OD4g,值<0.10，阴性对照血清平均OD4g值≤0.30.阳性对照血清平均OD4g值>1.0时，试验成立。
6ELISA结果判定
待检血清P/N≥2.1判定为阳性，P/N<2.1判为阴性。7Dot-ABC-ELISA
7.1试剂
生物素标记单抗：Bio-1F1、Bio-2B5和Bio-6G4单抗制备及标记参见附录F。7.1.2阴性对照抗原：牛血清白蛋白，检测时用PBS稀释至工作浓度（50ug/mL）。7.1.3
阳性对照抗原：猪囊尾坳TS-CC18重组抗原。检测时用PBS稀释至工作浓度（50μg/mL），制备方法参见附录D。
Avidin-HRP：亲和素-辣根过氧化物酶标记物、7.1.5
洗涤缓冲液：PBST，见C.2。
0.01mol/L磷酸盐缓冲液（PBS.pH7.2~7.4)：见C.3。20%三氯乙酸（TCA)：参见附录G中的G.1.1封闭液2：含1.0%明胶的0.01mol/LPBS(pH7.2~7.4)，参见G.1.2。DAB底物溶液：参见G.1.3。
2仪器设备
7.2.1NC膜（孔径0.45μm）。
圆形打孔器（直径6mm~8mm）。
7.2.31.5mL微量离心管。
GB/T18644—2020
7.2.4单道可调移液器（量程为0.5μL10μL、10μL～200μL和100μL～1000μL）。7.2.5
与各移液器匹配的标准吸头。
7.2.6台式低温高速离心机
7.2.737℃恒温培养箱。
7.2.837℃恒温摇床
7.2.9平血、锥形瓶。
7.2.10量筒（100mL和1000mL）。7.2.11暗盒。
7.3样品
采集猪全血，5mL/头，置4℃析出血清后，3000g离心15min，取上层血清用等体积20%TCA室温沉淀20min，4℃、10000g离心10min，吸取上清于干净离心管中，作为待检样品。7.4试验步骤
7.4.1NC膜预处理
裁切NC膜，大小0.8cm×10cm，可供检测10个样/条；点样处用圆形打孔器压迹，备用。7.4.2待检样品固定
取待检样品加至NC膜点样处.5μL/点，37℃结合至少2h。7.4.3洗涤
将固定样品的NC膜置于干净平皿，PBST重复漂洗3次。7.4.4封闭
将NC膜置于封闭液2中，37℃孵育1h。同7.4.3洗涤。7.4.5加生物素标记的单抗
将生物素标记的单抗Bio-1F1、Bio-2B5和Bio-6G4按1：1：1混勾，用PBS稀释（工作浓度均为1：100）。将NC膜置于稀释好的抗体工作液中，37℃摇床（50r/min）孵育1h，取出NC膜，用PBST进行洗涤。
7.4.6加亲和素-酶标记物
用PBS稀释Avidin-HRP（工作浓度1：500），与NC膜于37℃摇床（50r/min）孵育1h。移去液体，洗涤同7.4.3。
7.4.7加底物溶液
将NC膜置于新鲜配制的DAB显色液中，避光反应3min～5min。
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