中华人民共和国国家标准 GB/T 18644—2020 代替 GB/T 18644—2002 猪囊尾坳病诊断技术 Diagnostic techniques for porcine cysticercosis 发布日期：2020-12-14 | 实施日期：2020-12-14 前言 本标准按照 GB/T 1.1—2009 给出的规则起草。 本标准代替 GB/T 18644—2002《猪囊尾坳病诊断技术》，与 GB/T 18644—2002 相比，除编辑性修改外，主要技术变化如下： 一、范围部分增加了 PCR 和 Dot-ABC-ELISA 技术（见第 1 章）；增加了缩略语部分（见第 3 章）；增加了病原的 PCR 检测方法（见第 5 章）；修改了酶联免疫吸附试验的检测抗原和检测步骤，直接对血清样品进行抗体检测（见第 6 章，2002 年版的第 3 章）； 二、增加了检测循环抗原的 Dot-ABC-ELISA 方法（见第 7 章）；增加了综合判定（见第 8 章）； 三、增加了生理盐水及猪囊尾虫头节图片（见附录 A），PCR 引物位置、溶液配制及电泳图片（见附录 B），ELISA 试剂及其配制（见附录 C，2002 年版的附录 A），猪囊尾虫 TS-CC18 重组蛋白的制备（见附录 D），间接酶联免疫吸附试验加样示例（见附录 E），猪囊尾虫 TS-CC18 和烯醇化酶单克隆抗体的制备（见附录 F），Dot-ABC-ELISA 相关试剂配制及结果判定（见附录 G）。 请注意，本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由中华人民共和国农业农村部提出。本标准由全国动物卫生标准化技术委员会 (SAC/TC 181) 归口。 本标准起草单位：中国农业科学院兰州兽医研究所。 本标准主要起草人：才学鹏、骆学农、张少华、郑亚东、郭爱疆、侯俊玲。 引言 猪囊尾坳病 (Porcine cysticercosis) 是由猪带绦虫 (Taenia solium) 的幼虫所引起的一种危害严重的人兽共患寄生虫病。世界动物卫生组织将该病列为需申报的疾病之一。目前，该病广泛存在于发展中国家，而且发达国家的病例也有逐年增加的趋势，不仅影响养猪业的发展，造成巨大的经济损失，而且还严重威胁人类健康。 猪囊尾坳病的诊断包括病原学诊断与血清学诊断。病原学诊断的目的在于确定临床剖检样本中虫体的形态特征，在显微镜下观察头节顶突上有内外两圈排列整齐的小钩，即可判为猪囊尾蚴。若囊尾蚴主要寄生于肝脏，则要注意与亚洲带绦虫囊尾蚴相区别。目前，该病的生前诊断主要采用血清学方法，所用的抗原包括虫体抗原、囊液抗原或分泌代谢抗原等，虽然这些抗原的检测敏感性较高，但特异性差，而且抗原来源非常有限。鉴于以上原因，本次对 GB/T 18644—2002《猪囊尾坳病诊断技术》的修订，除间接 ELISA 所用抗原改为猪囊尾虫特异性 18ku 基因 (TS-CC18) 重组蛋白外，还增加了血清循环抗原 (CAg) 检测方法和病原的 PCR 检测方法，以满足猪囊尾病流行病学调查、药物治疗效果评价和动物流通风险评估等不同需求。 1 范围 本标准规定了猪囊尾坳病的显微镜检查、聚合酶链式反应法 (PCR 法)、间接酶联免疫吸附试验 (间接 ELISA)、斑点生物素-亲和素复合物酶联免疫吸附试验 (Dot-ABC-ELISA) 诊断技术及综合判定。本标准适用于猪和野猪的囊尾蚴病诊断。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 CNAS-GL 029:2018 基因扩增领域检测实验室认可指南 3 缩略语 下列缩略语适用于本文件 Avidin-HRP: 亲和素-辣根过氧化物酶 (Avidin-Horseradish Peroxidase) DAB: 二氨基联苯胺 (3,3-Diaminobenzidine) Dot-ABC-ELISA: 斑点生物素-亲和素复合物酶联免疫吸附试验 (Dot-Avidin-Biotin-Complex ELISA) ELISA: 酶联免疫吸附试验 (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) HRP: 辣根过氧化物酶 (Horseradish Peroxidase) IPTG: 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷 (Isopropyl β-D-Thiogalactoside) NC: 硝酸纤维素 (Nitrocellulose) OPD: 邻苯二胺 (o-phenylenediamine) PBS: 磷酸盐缓冲液 (Phosphate Buffered Saline) PBST: 洗涤液 (PBS containing 0.5% Tween-20) PCR: 聚合酶链式反应 (Polymerase Chain Reaction) TMB: 四甲基联苯胺 (3,3',5,5-Tetramethylbenzidine) 4 显微镜检查 4.1 试剂 生理盐水配制见附录 A 中的 A.1。 4.2 仪器设备 4.2.1 正置生物显微镜 4.2.2 手术剪、手术刀、镊子 4.2.3 载玻片 4.2.4 微量可调移液器（量程为 20 μL～200 μL） 4.3 虫体采集 肉眼观察舌肌、咬肌、内腰肌、膈肌、肩胛肌及心脏、肝脏、肺脏等组织，采集有可疑虫体寄生部位的肌肉或内脏组织，用手术刀将其切成约 1 cm 厚的薄片，仔细检查切口有无虫体。成熟的猪囊尾虫为长椭圆形，大小为 (6 mm~10 mm) × 5 mm，半透明，囊内充满液体，上有一栗粒大小的白色头节。脑内寄生的则为圆球形，直径 8 mm～10 mm。以手术刀和镊子剥离肌肉等组织中的囊尾虫，用生理盐水洗净。 4.4 压片制备 以手术剪剪开囊壁，取出完整的头节，以滤纸吸干囊液后，将其置于两张载玻片之间并压片。 4.5 显微镜检查 将压片置于低倍显微镜 (40×) 下，仔细观察虫体头节的形态和特征。 4.6 显微镜检查结果判定 如虫体头节的顶部有顶突，顶突上有内外两圈整齐排列的小钩（见图 A1），且顶突的稍下方有四个均等的圆盘状吸盘，即判为猪囊尾虫；如顶突无小钩则判为亚洲带绦虫囊尾蚴。猪囊尾虫应于 -20°C 或 -70°C 冰箱冻存。 5 PCR 法 5.1 试剂 5.1.1 PCR 试剂 5.1.1.1 10×PCR 缓冲液 5.1.1.2 dNTP 预混液 (2.5 mmol/L) 5.1.1.3 MgCl₂ (25 mmol/L) 5.1.1.4 Ex Taq 酶 (5 U/μL) 5.1.2 电泳试剂 5.1.2.1 电泳缓冲液：50×TAE 贮存液（见附录 B 中的 B.2.1），临用时加蒸馏水配成 1×TAE 缓冲液（见 B.2.2）。 5.1.2.2 琼脂糖：核酸电泳用琼脂糖。 5.1.2.3 电泳加样缓冲液：见 B.2.3。 5.1.2.4 DNA Marker（DNA 标志物）：条带大小依次为 100 bp、250 bp、500 bp、750 bp、1000 bp 和 2000 bp。 5.2 仪器设备 5.2.1 PCR 扩增仪 5.2.2 台式低温高速离心机