GB/T 16551-2020.Diagnostic techniques for classical swine fever.
1范围
GB/T 16551规定了猪瘟的临床症状与病理变化,样本的采集、保存、运输和处理,实验室病原学诊断方法以及实验室抗体检测方法等。
GB/T 16551适用于猪(家猪、野猪)的猪瘟诊断。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注明日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB 19489实 验室生物安全通用要求
GB/T 27540猪瘟病毒实时荧光RT-PCR检测方法
GB/T 34729-2017猪瘟病毒阻断ELISA抗体检测方法.
GB/T 35906猪瘟抗体间接ELISA检测方法
GB/T 36875猪瘟病毒RT-nPCR检测方法
NY/T 541兽医诊断样本采集、 保存与运输技术规范
3缩略语
下列缩略语适用于本文件。
CSF :猪瘟(Classical swine fever)
CSFV ;猪瘟病毒(Classical swine fever virus)
EDTA:乙二胺四乙酸(Ethylenediaminetetraacetic acid)
ELISA:酶联免疫吸附试验( Enzyme linked immunosorbent assay)
FAT:免疫荧光抗体试验( Fluorescent antibody test)
FITC:异硫氰酸荧光素( Fluorescein isothiocyanate)
HRP :辣根过氧化物酶( Horseradish peroxidase)
IPT :免疫过氧化物酶试验( Immunoperoxidase test)
MEM:基础Eagle培养基( Minimum eagle's medium)
NCU:国家临床单位( National clinical unit)
NIF :免疫荧光中和试验( Neutralization-immunofluorescence)

ICS11.220
中华人民共和国国家标准
GB/T16551—2020
代替GB/T16551-2008
猪瘟诊断技术
Diagnostic techniques for classical swine fever2020-12-14发布
国家市场监督管理总局
国家标准化管理委员会
2020-12-14实施
规范性引用文件
缩略语
临床症状与病理变化
临床症状
病理变化
结果判定
5样本的采集、保存、运输和处理5.1
样品采集
保存与运输
样本处理
实验室病原学诊断方法
免疫荧光抗体试验（FAT）
免疫过氧化物酶试验（IPT）
猪瘟病毒分离与鉴定
猪瘟病毒RT-nPCR检测方法
猪病毒实时荧光RT-PCR检测方法实验室抗体检测方法
猪瘟病毒中和试验
猪瘟病毒阻断ELISA抗体检测方法猪瘟抗体间接ELISA检测方法
猪瘟病毒化学发光抗体检测方法7.4
8综合判定·
附录A（规范性附录）
附录B（规范性附录）
附录C（规范性附录）
试剂配制·
猪瘟病毒TCID测定
校准品的制备
GB/T16551—2020
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。GB/T16551—2020
本标准代替GB/T16551—2008《猪瘟诊断技术》。与GB16551—2008相比，主要技术变化如下：修改了“范围”（见第1章，2008年版的第1章）；一增加了“规范性引用文件”（见第2章）；—增加了“缩略语”（见第3章）；修改了“临床及病理学诊断”部分，并更名为“临床症状与病理变化”（见第4章，2008年版的第2章）；
增加了“样本的采集、保存、运输和处理”部分（见第5章）；一修改了“病原学诊断\部分，并更名为“实验室病原学诊断方法”（见第6章，2008年版的第3章）；删除了“免体交互免疫试验”部分（见2008年版的3.1）；修改了“免疫酶染色试验”和“直接免疫荧光抗体试验”部分，更名为“免疫荧光抗体试验（FAT）”和“免疫过氧化物酶试验（IPT）”（见6.1、6.2,2008年版的3.2、3.4）；修改了“病毒分离与鉴定试验”部分，更名为“猪瘟病毒分离与鉴定”（见6.3.2008年版的3.3）；-删除了“猪瘟病毒反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）”（见2008年版的3.5）；增加了“猪瘟病毒RT-nPCR检测方法”和\猪瘟病毒实时荧光RT-PCR检测方法”（见6.4、6.5)；修改了“血清学诊断部分，并更名为“实验室抗体检测方法”（见第7章，2008年版的第4章）；修改了“荧光抗体病毒中和试验”部分，并更名为猪瘟病毒中和试验”（见7.1.2008年版的4.1);
删除了“猪瘟单抗酶联免疫吸附试验”（见2008年版的4.2）；增加了“猪瘟病毒阻断ELISA抗体检测方法”“猪瘟抗体间接ELISA检测方法”和“猪瘟病毒化学发光抗体检测方法”（见7.2、7.3、7.4)。本标准由中华人民共和国农业农村部提出。本标准由全国动物防疫标准化技术委员会（SAC/TC181)归口。本标准起草单位：中国兽医药品监察所。本标准主要起草人王琴、赵启祖、徐璐、王在时、张乾义、夏应菊、范学政、邹兴启、朱元源、李翠、丘惠深、赵耘、徐姬。
本标准所代替标准的历次版本发布情况为：—-GB/T16551—2008
GB/T16551—2020
猪瘟（Classicalswinefever，CSF）是由猪瘟病毒（Classicalswinefevervirus，CSFV）感染猪引起的一种高度接触性致死性传染性疾病，可造成巨大的经济损失和社会影响。被世界动物卫生组织（OIE）列为必须报告的疫病，我国规定CSF为一类动物疫病：猪包括野猪是本病唯一的自然宿主，发病猪和带毒猪是本病的传染源，不同年龄、性别、品种的猪均易感，一年四季均可发生。感染猪在发病前能通过分泌物和排泄物排毒，并持续整个病程。与感染猪直接接触是本病传播的主要方式，病毒也可通过精液、胚胎、猪肉和油水等方式间接传播，人、其他动物如鼠类和昆虫、器具等均可成为重要传播媒介。CSFV是黄病毒科（Flaviviridae)瘟病毒属（Pestivirus）的成员之一，只有1个血清型，3个基因型，10个基因亚型，不同基因型间有很好的抗原交叉反应。近年来，由于临床上出现了CSFV持续性感染所致的无典型临床症状和病理变化的慢性和隐性感染形式，以及多种疫病混合感染的现象，CSF的临床诊断和病理学诊断只能作为初步诊断的依据，对CSF病原的实验室检测是确定病毒感染的主要方法，要求诊断技术和标准更加特异和敏感。由于诊断的需求和诊断技术的发展，GB/T16551一2008已经不适应要求。针对CSF感染普通存在病毒载量低、病毒血症时间短等特点，最适用于活体动物的检测样本首先是扁桃体，其次为抗凝全血；若为病死动物，可采集扁桃体、脾脏、肾脏、胰脏、回肠、回盲瓣、肠系膜淋巴结和颌下淋巴结等含毒量较高的脏器进行检测。采用CSFV抗原免疫检测法L免疫荧光抗体试验（Fluorescentantibodytest，FAT）/免疫过氧化物酶试验（Immunoperoxidasetest，IPT）可检测感染组织和细胞中的病毒抗原，用于确诊；如果结果可疑或者样本不足，可以通过核酸检测技术确认如果样本量大，可采用猪瘟病毒实时荧光RT-PCR检测方法进行初筛，阳性者采用猪瘟病毒RT-nPCR检测方法和序列测定进行确诊和基因分型；上述都不能确诊的样本，采用经典的CSFV分离技术确诊，分离的病毒可用于进一步研究。上述三类方法均为OIE推荐的方法。目前，实施CSF疫苗全面免疫是我国防控CSF的重要手段，CSFV抗体检测主要用于CSF疫苗的免疫效果评价，而对于二些不实施免疫CSF疫苗的国家和地区来说，CSF抗体检测可以作为未免疫猪瘟疫苗猪群感染CSF的诊断依据。而在我国，ELISA方法已成为监测免疫后CSFV抗体保护水平、评价猪群免疫效果的最主要手段，根据检测目的不同，可选择不同的方法。对于我国CSF疫苗采取的全面免疫后而开展的大规模普查，间接ELISA抗体检测方法能够更加真实地反映中和抗体水平，为免疫程序制定和抗体水平监测提供可靠的数据支持；阻断ELISA抗体检测方法因其特异性强，可用于引种的种猪检测；化学发光抗体检测方法是近年来发展起来的一种新的酶联免疫检测方法，利用化学发光底物提高检测的灵敏度，同时增加检测的线性范围。本标准中的CSFV化学发光抗体检测方法中采用了CSFV抗体的校准品，并在检测中绘制校准曲线，可以使抗体检测结果相对定量。另外，采用该方法进行检测，能够大大缩短检测时间，适应于田间推广使用。最终的抗体确认可采用“金标准”方法病毒中和试验（Virusneutralizationtest，VNT）。ELISA方法和VNT两类方法均为OIE推荐的方法，也是国际贸易指定试验。
本标准中涉及了5种CSF病原和4种CSFV抗体的实验室检测方法，均可用于CSF病原和抗体的定性检测。使用者可根据自身的实验条件、能力水平以及待检样本的实际情况选择合适的方法。本文件的发布机构提请注意，声明符合本文件时，可能涉及7.2和7.3与CSFVE2蛋白表达及纯化相关的专利的使用。
本文件的发布机构对于该专利的真实性、有效性和范围无任何立场该专利持有人已向本文件的发布机构保证，他愿意同任何申请人在合理且无歧视的条款和条件下，IN
GB/T16551—2020
就专利授权许可进行谈判。该专利持有人的声明已在本文件的发布机构备案。相关信息可以通过以下联系方式获得：
专利持有人姓名：中国兽医药品监察所地址：北京中关村南大街8号。
请注意除上述专利外，本文件的某些内容仍可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。
1范围
猪瘟诊断技术
GB/T16551—2020
本标准规定了猪瘟的临床症状与病理变化，样本的采集、保存、运输和处理，实验室病原学诊断方法以及实验室抗体检测方法等。
本标准适用于猪（家猪、野猪）的猪瘟诊断、规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注明日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件GB19489实验室生物安全通用要求GB/T27540
猪瘟病毒实时荧光RT-PCR检测方法GB/T34729—2017猪瘟病毒阻断ELISA抗体检测方法GB/T35906
GB/T36875
NY/T541
缩略语
猪瘟抗体间接ELISA检测方法
猪瘟病毒RT-nPCR检测方法
兽医诊断样本采集、保存与运输技术规范下列缩略语适用于本文件。
CSF：猪瘟（Classical swinefever)CSFV：猪瘟病毒（Classical swinefevervirus)EDTA：乙二胺四乙酸（Ethylenediaminetetraaceticacid）ELISA：酶联免疫吸附试验（Enzymelinkedimmunosorbentassay）FAT：免疫荧光抗体试验（Fluorescentantibodytest）FITC：异硫氰酸荧光素（Fluoresceinisothiocyanate）HRP：辣根过氧化物酶（Horseradishperoxidase）IPT：免疫过氧化物酶试验（Immunoperoxidasetest）MEM：基础Eagle培养基（Minimumeagle'smedium）NCU：国家临床单位（National clinical unit）NIF：免疫荧光中和试验（Neutralization-immunofluorescence）NPLA：过氧化物酶联中和试验（Neutralizationperoxidase-linkedantibody）PBS：磷酸盐缓冲溶液（Phosphatebufferedsaline）PK-15：猪肾传代细胞系（Pigkidney-15cellline）RT-nPCR:巢式PCR技术(Reversetranscriptionnestpolymerasechainreaction）RT-PCR：反转录聚合酶链式反应（Reversetranscriptionpolymerasechainreaction）TCID：组织半数感染剂量（5o%tissuecultureinfectivedose）1
GB/T16551—2020
4临床症状与病理变化
临床症状Www.bzxZ.net
猪群中被检猪出现下列临床症状时，可作为综合诊断定性的依据之一：a)
发病急、病死率高；
体温≥40.5℃或间歇性发热；
精神萎靡、畏寒、厌食甚至废食，呕吐、步态不稳或跛行；先便秘后腹泻，或便秘和腹泻交替出现；d)
腹部皮下、异镜、耳尖、四肢内侧均可出现紫色出血斑点，指压不褪色，结膜炎：f）
怀孕母猪有流产、死胎、“木乃伊”胎或所产仔猪有衰弱、震颤、挛、发育不良等现象。4.2
病理变化
对临床检出的可疑患猪可进行病理学诊断，下述肉眼可见的病理变化可作为综合诊断定性的依据之一：
淋巴结水肿、出血，呈现红白相间“大理石样变”：肾脏呈土黄色，表面可见出血点，部分病例可见雀斑肾；b)
全身浆膜、黏膜和心脏、膀胱、胆囊、扁桃体均可见出血点和出血斑；脾脏不肿大，表面有点状出血或边缘出现突起的楔状梗死区；d)
慢性CSF在回肠末端、盲肠和结肠常见“纽扣状”溃疡4.3
结果判定
易感猪出现4.1或4.2的情况，可判定为疑似CSF。确诊应采集有临床症状或病理变化的猪的扁桃体、脾脏、肾脏、胰脏、回肠、回盲瓣、肠系膜淋巴结和颌下淋巴结等组织（若无法采集组织，也可采集抗凝全血，但会大大降低检测的敏感性）按实验室病原学诊断方法进行确诊。
5样本的采集、保存、运输和处理5.1
扁桃体活体采样箱（包括鼻捻子、开口器和采样枪）。无菌剪刀。
无菌镊子。
无菌离心管。
无菌注射器。
医用EDTA抗凝采血管。
一次性密封袋。
组织匀浆器或研磨器。
冷冻离心机。
2试剂
MEM培养液
5.2.2双抗储液，见A.1。
5.2.375%酒精，见A.2。
5.3样品采集
5.3.1活体动物扁桃体的采集
GB/T16551—2020
采集活体猪扁桃体时，用异捻子固定猪上唇，用开口器打开口腔，用采样枪采集扁桃体样本，放入离心管中并编号。
5.3.2活体动物抗凝全血的采集
采用75%酒精对待采血动物颈部前腔静脉表面皮肤进行擦拭消毒。用无菌注射器于前腔静脉采血，立即注人医用EDTA抗凝采血管，充分混匀后编号备用。5.3.3组织样品采集
病死猪可采集扁桃体、淋巴结、胰脏、脾脏、回肠、肝脏和肾脏等含毒量较高的组织脏器。若组织或脏器出现了典型的病理变化，宜采集病健交界处的组织.不宜采集病变严重且出现继发感染（如细菌污染的组织。采样时用无菌的剪刀和镊子剪切至少1g，装人一次性自封袋或离心管，编号。5.4保存与运输
采集的样本应放人主容器密封后，采用保温容器加冰袋或干冰密封.应在8h之内运送到实验室。样本相关生物安全标识和运送流程应按照NY/T541的相关规定执行样本到达实验室后，在2℃～8℃条件下保存应≤24h。若需长期保存，应放置于超低温冰箱（≤一70℃），避免反复冻融。5.5样本处理
5.5.1生物安全措施
样本处理的生物安全措施按GB19489规定的相关操作进行5.5.2组织样本的处理
将病料用无菌眼科剪和眼科镊进行修剪（病灶与健康组织的交界处），处理不同组织病料应更换手套并消毒操作器械。取1g大小的病料组织，置于无菌离心管中，再向其中加人无菌MEM培养液（含2%双抗）1mL。在2℃～8℃温度下置于匀浆机中匀浆，将勾浆液于4℃温度下8000r/min离心5min，取上清，置于另一个无菌离心管中，待检5.5.3抗凝全血的处理
将抗凝全血样本直接分装于无菌离心管中，在4℃下8000r/min离心5min，取上清，置于另一个无菌离心管中，待检。
实验室病原学诊断方法
6.1免疫荧光抗体试验（FAT)
6.1.1概述
本方法快速、特异，可用于检测扁桃体、淋巴结、脾脏、胰脏、肾脏和回肠远端等组织样品的冰冻切片GB/T16551—2020
或触片以及细胞培养物中的病毒抗原。样本需在无防腐剂的冷藏条件下运送，但样本不能冻结。根据FITC标记的抗体不同，可分为直接法和间接法6.1.2器材
倒置荧光显微镜。
恒温培养箱
6.1.2.3湿盒（带盖子的长方形容器，底部铺一层湿纱布）。6.1.2.4盖玻片。
微量移液器（200μL、1000μL）。6.1.3试剂
PBS缓冲液，见A.3。
丙酮，-20℃预冷。
固定液，见A.9。
6.1.3.4缓冲甘油，见A.4。
6.1.3.5抗体：直接法采用FITC标记的抗CSFV的单克隆或多克隆抗体；间接法采用抗CSFV的单克隆或多克隆抗体及相应的FITC标记二抗。6.1.4操作步骤
6.1.4.1将待检的组织样本制成冰冻切片或触片，将液体吸干后用预冷的丙酮固定5min～10min，自然干燥；细胞培养物弃去孔中液体，用PBS缓冲液漂洗3次后，自然干燥，每孔加人适量固定液固定30min。每个样本应做3个重复切片或触片。固定后用PBS缓冲液漂洗3次，自然干燥。同时采用阳性组织和阴性组织进行相同处理，分别作为阳性对照和阴性对照。6.1.4.2染色方法，以下两种可任选其一：a)
直接法：滴加工作浓度的FITC标记的抗CSFV的单克隆或多克隆抗体，覆盖于样本表面，置37℃湿盒避光作用30min～40min，用PBS缓冲液洗涤3次。b）间接法：滴加工作浓度的抗CSFV的单克隆或多克隆抗体，覆盖于样本表面，置37℃湿盒作用1h后，用PBS缓冲液洗涤3次，再加人工作浓度的FITC标记二抗，置37℃湿盒避光作用30min~40min，用PBS缓冲液洗涤3次。6.1.4.3将组织切片放置室温干燥5min，于组织样本表面滴加适量缓冲甘油，用盖玻片覆盖样本：细胞培养物表面滴加适量PBS缓冲液。将样本直接置于倒置荧光显微镜下观察结果6.1.4.4实验成立条件和结果判定：当细胞胞浆中出现亮绿色荧光着染时，判为染色阳性：细胞胞浆无着染，判为染色阴性。当阳性对照为染色阳性，阴性对照为染色阴性时，实验结果成立。待检样本的3个重复切片或触片中至少一个出现染色阳性时.即判该样本为CSFV阳性；否则，判为阴性6.2免疫过氧化物酶试验（IPT）6.2.1概述
本方法原理与FAT相似，但抗体标记物为HRP，根据标记的抗体不同，可分为直接法和间接法。在普通光学显微镜下可观察结果，且细胞板或组织切片能长期保存、反复观察，6.2.2器材
器材包括倒置光学显微镜和其他器材（按6.1.2.2~6.1.2.5执行）。4
6.2.3试剂
GB/T16551—2020
抗体：直接法采用HRP标记的抗CSFV的单克隆或多克隆抗体，间接法采用抗CSFV的单克隆或多克隆抗体及相应的HRP标记二抗。底物显色液见A.5。
其他试剂按照6.1.3.1~6.1.3.4执行。6.2.4操作步骤
6.2.4.1操作步骤按照6.1.4.1执行。2染色方法，以下两种可任选其一：6.2.4.2
直接法：滴加工作浓度的HRP标记的抗CSFV的单克隆或多克隆抗体，覆盖于样本表面，置a）
37℃湿盒避光作用30min~40min，用PBS缓冲液洗涤3次。间接法：滴加工作浓度的抗CSFV的单克隆或多克隆抗体，覆盖于样本表面，置37℃湿盒作用b)
1h后，用PBS缓冲液洗涤3次，再加入工作浓度的HRP标记二抗，置37℃湿盒避光作用30min～40min，用PBS缓冲液洗涤3次。3组织样本表面滴加适量底物显色液，室温反应，待出现红褐色显色时，弃去底物显色液，用蒸馏6.2.4.3
水漂洗，终止显色反应。
6.2.4.4将组织切片放置室温干燥5min，于组织样本表面滴加适量缓冲甘油，用盖玻片覆盖样本；细胞培养物表面滴加适量PBS缓冲液。样本直接置于普通光学显微镜下观察。6.2.4.5实验成立条件和结果判定：当细胞浆中出现红褐色着染时，判为染色阳性；细胞胞浆无着染，判为染色阴性。当阳性对照为染色阳性，阴性对照为染色阴性时，实验结果成立。待检样本的3个重复中至少一个出现染色阳性时，即判该样本为CSFV阳性；否则，判为阴性。猪瘟病毒分离与鉴定
6.3.1器材
25cm细胞培养瓶。
24孔细胞培养板
细胞计数器。
微量移液器（200μL，1000μL）。一次性针式滤器（0.45uμm，0.22μm）。二氧化碳温箱。
倒置荧光显微镜（FAT染色）或普通光学显微镜（IPT染色）。6.3.2
胰酶，见A.6。
PBS缓冲液见A.3。
MEM培养液。
双抗储液（100倍），见A,1。
细胞生长液，见A.7。
病毒维持液，见A.8。
固定液，见A.9。
抗体稀释液，见A.10。
GB/T16551—2020
6.3.2.9阳性对照：猪瘟免化弱毒疫苗C株细胞毒，病毒滴度为105.TCID5c/0.1mL。6.3.2.10阴性对照：PK-15细胞培养上清。6.3.2.11PK-15细胞，或对病毒敏感性不低于PK-15细胞的猪肾和猪睾丸传代细胞系。6.3.2.122%NaOH消毒液，见A.11。6.3.3操作步骤
6.3.3.1细胞的制备：分离病毒前24h～36h制备细胞。用胰酶消化处于对数生长期的PK-15细胞单层，将所得细胞悬液以1500r/min离心5min，并用细胞生长液将细胞重悬，细胞计数器计数，调整细胞浓度至2×10″个/mL，备用：也可取适量细胞悬液加人细胞培养瓶或24孔细胞培养板制备细胞单层.待细胞长至60%～70%铺满孔底时备用。6.3.3.2待检样本的准备：取5.5.2和5.5.3中制备的组织悬液或全血，用0.45μm一次性针式滤器过滤，收集滤出液备用。
6.3.3.3病毒接种和培养。以下2种接种方式可选其一：同步接种：取9份细胞悬液（见6.3.3.1）和1份待检样本（见6.3.3.2）进行混合，取5mL混合液a)
加人细胞培养瓶中，同时接种24孔细胞培养板2孔，每孔0.5mL：24孔细胞培养板上同时接种猪瘟兔化弱毒疫苗C株细胞毒作为阳性对照（9份细胞悬液和1份细胞毒）2孔和阴性对照（9份细胞悬液和1份PK-15细胞培养上清）2孔，每孔0.5mL。操作时一定要避免交叉污染，当接种完待检样本后，做好标记，置于37℃含5%二氧化碳温箱中培养72hb）单层细胞接种：待6.3.3.1中的细胞长至60%～70%细胞单层后，弃去细胞培养上清，按细胞培养液1/10体积加入处理后的待检样本（见6.3.3.2）于细胞培养瓶和24孔细胞培养板中，24孔细胞培养板中同时接种0.2mL阳性对照和阴性对照各2孔。置于37℃含5%二氧化碳温箱中吸附1h，期间每隔15min晃动一次细胞瓶/板，使液体全部浸润细胞，防止细胞过分干燥死亡。吸出孔中液体，弃于2%NaOH溶液中进行灭活，用无血清MEM培养液漂洗瓶/板中细胞3次。加入适量细胞维持液于细胞培养瓶或细胞培养板中（例如：25cm细胞培养瓶加人5mL维持液，24孔细胞培养板加人维持液0.5mL1mL）；37℃含5%二氧化碳温箱中放置72h。
6.3.3.4检测和结果判定。病毒接种后72h，取出细胞培养板.吸出孔中液体于2%NaOH溶液中灭活。用PBS漂洗3次，置通风橱下干燥5min，用一20℃预冷的固定液固定30min以上。弃去孔中固定液PBS缓冲液漂洗3次。可采用6.1或6.2的方法进行检验和结果判定。6.3.3.5病毒传代及扩大培养。如需对病毒阳性样本进行扩大培养，取出接种样本的细胞瓶反复冻融3次后收集瓶中液体，5000g离心5min，收集上清，即为F1代病毒细胞培养物：重复6.3.3.3～6.3.3.5共2次，进行扩大培养，获得第3代阳性培养物，冻存备用。根据需要对获得的阳性培养物进行病毒滴度测定（见附录B）或基因分型等研究。如对检测结果有疑问可按上述方法盲传2代并进行检测。6.4猪瘟病毒RT-nPCR检测方法
猪瘟病毒RT-nPCR检测方法按照GB/T36875执行。6.5猪瘟病毒实时荧光RT-PCR检测方法猪瘟病毒实时荧光RT-PCR检测方法按照GB/T27540执行7
实验室抗体检测方法
7.1猪瘟病毒中和试验
根据抗体标记物的不同.猪瘟病毒中和实验可分为NIF和NPLA。6
7.1.1免疫荧光中和试验（NIF）7.1.1.1器材
7.1.1.1.1
7.1.1.1.2
7.1.1.1.3
7.1.1.1.4
7.1.1.1.5
7.1.1.1.6
7.1.1.1.7
7.1.1.1.8
7.1.1.1.9
单道微量移液器（20μL、200μL）。多道移液器（200μL）。
96孔细胞培养板。
无菌移液器吸头（200μL)。
无菌离心管。
生物安全柜。
水浴锅。
二氧化碳温箱。
倒置荧光显微镜。
7.1.1.2.1
7.1.1.2.2
7.1.1.2.3
7.1.1.2.4
7.1.1.2.5
7.1.1.2.6
7.1.1.2.7
7.1.1.2.8
7.1.1.2.9
MEM培养液。
病毒维持液，见A.8
CSFV抗体阳性血清
CSFV抗体阴性血清。
PK-15细胞。
猪瘟兔化弱毒疫苗C株细胞毒。
固定液，见A.9。
PBS缓冲液，见A.3。
抗体稀释液，见A.10。
抗体，见6.1.3.5。
7.1.1.2.10
检验步骤
7.1.1.3.1
7.1.1.3.2
GB/T16551—2020
细胞的准备：用96孔细胞培养板培养PK-15细胞，待细胞铺满孔底60%~70%时，备用。血清的灭活：用移液器吸取100μL待检血清、CSFV抗体阳性和阴性对照血清，分装于无菌离心管中，一份血清换一个移液器吸头。将分装后的待检血清和对照血清置于56℃水浴锅中灭活30min。
7.1.1.3.3
病毒的稀释：在血清灭活期间，取适量已知毒价的猪瘟免化弱毒疫苗细胞毒（猪瘟病毒TCIDs测定见附录B）用含1%双抗的无血清MEM培养液将病毒稀释至200TCID/0.1mL。7.1.1.3.4血清与病毒的中和：取1块96孔细胞培养板（记为板I），每孔加人含1%双抗的无血清MEM培养液80μL。将7.1.1.3.2灭活后的待检血清和对照血清按顺序加人上述培养液中，每孔20μL，每份血清做2个重复。此时，待检/对照血清均被稀释5倍。血清稀释后，向板中每孔加入100μL7.1.1.3.3中的病毒液.此时血清的最终稀释倍数为10倍。将板I置于37℃含5%二氧化碳温箱中孵育1h。
7.1.1.3.5孵育结束后，将7.1.1.3.1中制备的PK-15细胞板（记为板Ⅱ），用多道移液器吸净上清，然后迅速加入板I中对应孔中的血清-病毒混合液，每孔100uL，注：进行此步骤操作时，以两列为单位进行操作，例如：先用多道移液器吸净板IⅡI中1列、2列细胞培养液，然后迅速从板I中吸取1列、2列孔中液体加入板Ⅱ的对应孔中。7.1.1.3.6将板Ⅱ置于37℃含5%二氧化碳温箱中孵育1h。7.1.1.3.7
取出板Ⅱ，每孔加入维持液100L，37℃含5%二氧化碳温箱中孵育72h。7
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