GB/T 38481-2020.Determination of ultralow-frequency mutations for microorganisms-Duplex sequencing.
1范围
GB/T 38481规定了用双重测序法测定微生物超低频突变的方法。
GB/T 38481适用于微生物基因组或基因片段超低频突变的测定。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1
超低频突变 ultralow-frequency mutations
化学、物理或生物因素导致微生物DNA发生的频率低于1X 10-的永久性改变。
3.2
条形码标签 barcode label
接在待测DNA片段两侧的核苷酸片段,用以标示同一扩增家族的DNA.协助进行突变位点的确认。
3.3
互补标签家族 complementary tag family
所有含两端互补条形码标签的DNA片段。
3.4
双链同源序列 double-strand consensus sequences;DCSs
带有相同条形码标签的双链DNA序列,包含反向互补链。
4原理
在待测DNA片段两端接上一段12 nt随机且互补的双链核苷酸条形码标签,然后对所有带有条形码标签的序列进行双重的高通量测序。利用12 nt随机互补标签，排除掉测序文库制备过程中所引入的突变,进而准确检测突变位点和突变率。
5试剂
除非另有规定,仅使用分析纯试剂。
5.1 水。GB/T 6682,一级。
本标准规定了用双重测序法测定微生物超低频突变的方法。 本标准适用于微生物基因组或基因片段超低频突变的测定。

ICS07.080
中华人民共和国国家标准
GB/T38481—2020
微生物超低频突变测定
双重测序法
Determination of ultralow-frequency mutations for microorganisms-Duplex sequencingwwW.bzxz.Net
2020-11-19发布
国家市场监督管理总局
国家标准化管理委员会
2020-11-19实施
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草本标准由中国标准化研究院提出并归口。GB/T38481—2020
本标准起草单位：清华大学、洛阳华清天木生物科技有限公司、江汉大学、中国标准化研究院。本标准主要起草人：张独、邢新会、李梅、剪兴金、王立言、郭肖杰、张乐乐、彭海、马爱进、I
1范围
微生物超低频突变测定
双重测序法
本标准规定了用双重测序法测定微牛物超低频突变的方法。本标准适用于微生物基因组或基因片段超低频突变的测定。规范性引用文件
GB/T38481—2020
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用干本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。3.1
超低频突变
ultralow-frequency mutations化学、物理或生物因素导致微生物DNA发生的频率低于1X10-5的永久性改变。3.2
条形码标签
barcode label
接在待测DNA片段两侧的核昔酸片段，用以标示同一扩增家族的DNA，协助进行突变位点的确认。
互补标签家族
complementarytagfamily
所有含两端互.补条形码标签的DNA片段。3.4
双链同源序列
double-strandconsensus sequences;DCSs带有相同条形码标签的双链DNA序列，包含反向互.补链。4原理
在待测DNA片段两端接上一段12nt随机且互补的双链核昔酸条形码标签，然后对所有带有条形码标签的序列进行双重的高通量测序。利用12nt随机互补标签，排除掉测序文库制备过程中所引入的突变，进而准确检测突变位点和突变率。6
除非另有规定，仅使用分析纯试剂。5.1水。GB/T6682，一级。
5.2接头链标签序列：
GB/T38481—2020
a）5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3'；b)5'-TCTTCTACAGTCANNNNNNNNNNNNAGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC-3°N为A、T、C或G，由12个随机碱基组成标签片段。将寡核苷酸溶解于Tris-EDTA缓冲液（5.8)或纯水中至终浓度100μmol/L，并放置干一20℃保存。
5.3接头链扩增引物序列：
a）5'-AATGATACGGCGACCACCGAG-3'；b）5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATXXXXXXGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGC-3'。X为按样品需求设计的文库标记序列。将寡核苷酸溶解于Tris-EDTA缓冲液（5.8)或纯水中至终浓度20μmol/L,并放置于一20℃保存。5.4基因提取试剂盒。
5.5高通量测序建库试剂盒。
5DNA分选磁珠试剂盒。
DNA分析试剂盒。
三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸（Tris-EDTA)缓冲液，pH8.0。由10mmol/L的分析纯Tris和0.1mmol/L的EDTA配制，调整pH值至8.0。6仪器设备及器具
PCR扩增仪。
2磁性分离器。
3高通量测序仪。
核酸分析系统。
5电子天平：精度为0.01g。
7样品制备
DNA提取
利用微生物基因组或质粒提取试剂盒对待测样本进行基因组或质粒DNA提取操作，最后使用50μL的无菌双蒸水进行DNA洗脱。提取得到的DNA样品使用核酸定量仪检测核酸的浓度和纯度7.2
DNA片段化和末端修复
利用高通量基因测序建库试剂盒，将待测样品DNA片段化至100bp～1000bp，将末端修复为A尾。
8接头条形码标签的合成
8.1退火
将浓度100umol/L的两个接头链寡核苷酸片段各取100μL进行退火，在95℃下加热5min后，自然降温，并静置1h。
2延伸
将8.1中得到的产物按试剂说明与脱氧核糖核苷三磷酸混合物（dNTPs)和克列诺酶混合均勾，分装至两个0.2mL的PCR管中并在37℃下孵育1h，2
8.3DNA回收
使用无水乙醇沉淀DNA，并加人200μL纯水溶解。8.4酶切
GB/T38481—2020
用限制性内切酶HpyCH4Ⅲ对DNA产物进行酶切。将混合物分装至4个0.2mL的PCR管中，并在37℃孵育16h。
8.5纯化
加人并均匀混合50uL的3mol/L乙酸钠溶液（pH5.2），最终体积为550uL。将混合溶液平分到1.5mL的具寒离心管内，每管275μL,并加入625μL室温的无水乙醇到各管中。充分混匀，并以大于10000r/min的转速在4℃下离心30min。移除上清液后，加人1mL的75%（体积分数)乙醇至各管中。充分混匀，并立即以大于10000r/min的转速在4℃下离心30min。
移除上清液后，在纸巾上倒置试管10min以干燥，接着正置5min。加人100uL的Tris-EDTA缓冲液至上一步骤产物中并混合均匀。将所有试管集在一起，最终体积为200μL，终浓度约为50μmol/L，放人一20℃的冰箱中保存。9接头条形码标签与待测样本DNA的连接和扩增9.1连接
将互.补条形码标签与DNA片段化和末端修复产物按总浓度20：1混合后，利用T4DNA连接酶连接，在25℃解育15min。
2分选
利用DNA分选磁珠试剂盒分选得到的产物，获得长度为200bp～900bp的DNA片段，并以DNA试剂盒定量DNA浓度。
9.3PCR扩增
以分选产物为模板，接头链扩增引物序列为引物，按每20万读数数据量取1amolDNA样量进行PCR扩增，扩增程序根据所选用高保真DNA聚合酶的要求设定。10
高通量测序
利用高通量测序试剂盒对扩增得到的PCR产物进行高通量测序，每个待测样品测序碱基数量设置为大干或等于10 Gb。
11结果分析
对高通量测序数据进行清理，然后按下列程序进行数据分析：根据随机标签进行互补标签分类，每个家族需包含双向互补序列。互补标签家族大小分布a）
在排除1之后，最大峰值分布应于6～12之间。b）双链同源序列在同一位点识别出突变才视为真正的突变位点。GB/T38481—2020
结果计算与表述
结果计算
突变率按式(1)计算：
式中：
——突变率；
N.——双链同源序列突变位点数；N,——不含标签的测序核苷酸总数。12.2
结果表述
结果表述为待测样本的突变率M。SZAC
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