中华人民共和国国家标准 GB/T38481—2020 微生物超低频突变测定 双重测序法 Determination of ultralow-frequency mutations for microorganisms-Duplex sequencing 发布日期：2020-11-19 实施日期：2020-11-19 1 范围 本标准规定了用双重测序法测定微生物超低频突变的方法，适用于微生物基因组或基因片段的超低频突变测定。 2 规范性引用文件 GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 3.1 超低频突变 ultralow-frequency mutations：化学、物理或生物因素导致微生物DNA发生频率低于1×10^-5的永久性改变。 3.2 条形码标签 barcode label：接在待测DNA片段两侧的核苷酸片段，用以标示同一扩增家族的DNA，协助确认突变位点。 3.3 互补标签家族 complementary tag family：所有含两端互补条形码标签的DNA片段。 3.4 双链同源序列 double-strand consensus sequences (DCSs)：带有相同条形码标签的双链DNA序列，包含反向互补链。 4 原理 在待测DNA片段两端接上一段12nt随机且互补的双链核苷酸条形码标签，然后对所有带有条形码标签的序列进行双重高通量测序。利用12nt随机互补标签，可排除测序文库制备过程中引入的突变，准确检测突变位点和突变率。 5 试剂 除非另有规定，仅使用分析纯试剂。 5.1 水：GB/T6682，一级水。 5.2 接头链标签序列：a）5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3'；b）5'-TCTTCTACAGTCANNNNNNNNNNNNAGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC-3'。N为A、T、C或G，由12个随机碱基组成。溶解于Tris-EDTA缓冲液或纯水中至终浓度100 μmol/L，置于-20℃保存。 5.3 接头链扩增引物序列：a）5'-AATGATACGGCGACCACCGAG-3'；b）5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATXXXXXXGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGC-3'。X为按样品设计的文库标记序列。溶解于Tris-EDTA缓冲液或纯水中至终浓度20 μmol/L，置于-20℃保存。 5.4 基因提取试剂盒 5.5 高通量测序建库试剂盒 5.6 DNA分选磁珠试剂盒 5.7 DNA分析试剂盒 5.8 三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸（Tris-EDTA）缓冲液，pH 8.0，由10 mmol/L分析纯Tris和0.1 mmol/L EDTA配制。 6 仪器设备及器具 6.1 PCR扩增仪 6.2 磁性分离器 6.3 高通量测序仪 6.4 核酸分析系统 6.5 电子天平，精度0.01 g 7 样品制备 7.1 DNA提取：利用微生物基因组或质粒提取试剂盒提取DNA，使用50 μL无菌双蒸水洗脱。提取DNA样品用核酸定量仪测定浓度和纯度。 7.2 DNA片段化和末端修复：利用高通量建库试剂盒，将DNA片段化至100~1000 bp，并末端修复为A尾。 8 接头条形码标签的合成 8.1 退火：将浓度100 μmol/L的两个接头链寡核苷酸各取100 μL，95℃加热5 min后自然降温，静置1 h。 8.2 延伸：将8.1产物按试剂说明与dNTPs和聚合酶混合进行延伸反应。