GB/T 38740-2020
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标准简介
GB/T 38740-2020.Laboratory animal-Method for examination of simian Marburg virus (MARV).
1范围
GB/T 38740规定了猴马尔堡病毒实时荧光RT-PCR检测的操作方法。
GB/T 38740适用于猴马尔堡病毒的检测。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法
GB/T 18088出入境动物检疫采样
GB 19489实验室生物安 全通用要求
3术语和定 义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1
马尔堡病毒 Marburg virus
一种高致病性病毒,属丝状病毒科(Filoviridae),单股负链RNA病毒,基因组约19.1kb,为已知的最大的负链RNA病毒。
3.2
逆转录实时荧光聚合酶链式反应 real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction; real-time RT-PCR
将mRNA逆转录为cDNA后再作为模板进行实时荧光PCR扩增。PCR反应体系中加入一对引物的同时加入一条特异性的荧光探针,该探针为一寡核苷酸片段,两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;PCR特异性扩增时,Taq酶的5'-3'外切酶活性将探针酶切降解,使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离,从而荧光监测系统可接收到荧光信号,实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。
3.3
噪音 noise
荧光PCR仪在仅仅使用PCR管和水的状态下的本底荧光强度。
3.4
Ct值 cycle threshold value
从基线到指数增长的拐点所对应的PCR反应循环次数。
1范围
GB/T 38740规定了猴马尔堡病毒实时荧光RT-PCR检测的操作方法。
GB/T 38740适用于猴马尔堡病毒的检测。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法
GB/T 18088出入境动物检疫采样
GB 19489实验室生物安 全通用要求
3术语和定 义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1
马尔堡病毒 Marburg virus
一种高致病性病毒,属丝状病毒科(Filoviridae),单股负链RNA病毒,基因组约19.1kb,为已知的最大的负链RNA病毒。
3.2
逆转录实时荧光聚合酶链式反应 real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction; real-time RT-PCR
将mRNA逆转录为cDNA后再作为模板进行实时荧光PCR扩增。PCR反应体系中加入一对引物的同时加入一条特异性的荧光探针,该探针为一寡核苷酸片段,两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;PCR特异性扩增时,Taq酶的5'-3'外切酶活性将探针酶切降解,使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离,从而荧光监测系统可接收到荧光信号,实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。
3.3
噪音 noise
荧光PCR仪在仅仅使用PCR管和水的状态下的本底荧光强度。
3.4
Ct值 cycle threshold value
从基线到指数增长的拐点所对应的PCR反应循环次数。
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标准内容
ICS65.020.30
中华人民共和国国家标准
GB/T38740—2020
实验动物
猴马尔堡病毒检测方法
Laboratory animalMethod for examination of simian Marburg virus (MARV)2020-04-28发布
国家市场监督管理总局
国家标准化管理委员会
2020-08-01实施
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由全国实验动物标准化技术委员会（SAC/TC281)提出并归口。GB/T38740—2020
本标准起草单位：海南出入境检验检疫局检验检疫技术中心、中华人民共和国福州海关、中华人民共和国成都海关、中华人民共和国海口海关、中华人民共和国济南海关、北京脑科学与类脑研究中心、中华人民共和国海口海关、中华人民共和国昆明海关。本标准主要起草人：李丹丹、张体银、安微、王绥家、凌宗帅、李文龙、陈平亚、艾军。1
1范围
实验动物
猴马尔堡病毒检测方法
本标准规定了猴马尔堡病毒实时荧光RT-PCR检测的操作方法。本标准适用于猴马尔堡病毒的检测。2规范性引用文件
GB/T38740—2020
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T18088出入境动物检疫采样
GB19489实验室生物安全通用要求术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。3.1
Marburgvirus
马尔堡病毒
一种高致病性病毒，属丝状病毒科（Filoviridae），单股负链RNA病毒，基因组约19.1kb，为已知的最大的负链RNA病毒。
逆转录实时荧光聚合酶链式反应real-time quantitativereverse transcriptionpolymerase chainre-action;real-timeRT-PCR
将mRNA逆转录为cDNA后再作为模板进行实时荧光PCR扩增。PCR反应体系中加人一对引物的同时加入一条特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸片段，两端分别标记一个报告荧光基团和个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR特异性扩增时，Tag酶的5°-3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和萍灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。3.3
噪音noise
荧光PCR仪在仅仅使用PCR管和水的状态下的本底荧光强度。3.4
Ct值cycle threshold value
从基线到指数增长的拐点所对应的PCR反应循环次数。4缩略语
下列缩略语适用于本文件。
GB/T38740—2020
DEPC：焦碳酸二乙酯（diethylpyrocarbonate）dNTP：脱氧核苷三磷酸（deoxyribonucleosidetriphosphate）FAM：6-羧基荧光素（6-carboxy-fluorescein）MARV：马尔堡病毒（Marburgvirus）PBS：磷酸盐缓冲液（phosphate-bufferedsaline）RNA：核糖核酸(ribonucleicacid）RT-PCR：逆转录聚合酶链式反应（reversetranscriptionpolymerasechainreaction）SDS：十二烷基硫酸钠（sodiumdodecylsulfate）TAMRA：6-羧基四甲基若丹明（6-carboxytetramethylrhodamine）Taq酶：TagDNA聚合酶（TagDNApolymerase)Tris：三（羟甲基）氨基甲烷[tris(hydroxymethyl）aminomethane]5试剂或材料
本标准所用水应符合GB/T6682中一级水的规格要求5.1裂解液：Trizol或其他等效裂解液。5.2
三氯甲烷：异戊醇：体积比24：1。5.3
异丙醇：-20℃预冷。
磷酸盐缓冲液（PBS)：见附录A中的A.1。无RNase水：见A.2
75%乙醇：见A.3。
10XRT-PCR缓冲液。
dNTPs：含dCTP、dGTP、dATP、dTTP各2.5mmol/L。5.9
MgCl:25mmol/L
TaqQDNA聚合酶：一20℃保存，避免反复冻融或温度剧烈变化RNA酶抑制剂。
阳性对照：体外转录的、非感染性的、猴马尔堡病毒阳性RNA片段，DNA序列参见附录B阴性组织对照：猴马尔堡病毒阴性组织样品。5.15
引物和探针，浓度为10mol/L.序列如下：上游引物MARV-F:5-TTGGTGCGGACCTCCAAAGT-3；下游引物MARV-R:5-GCGCAATTGCTGAGAGCTGA-3：探针:5'-FAM-AGCAGGCGTTGAGCAACCTAGCCCGA-BHQI-3。6仪器设备
6.1荧光定量PCR核酸扩增仪。
2生物安全柜。
3电子天平。
6.4高速冷冻离心机，台式离心机。6.5
5冷藏冷冻冰箱。
6.6组织匀浆器。
旋涡振荡器。
6.8微量可调移液器：2μ、10μ、20μL、100μL、200μ、1000μ。6.9
低温冰箱，温度≤一70℃。
7样品采集
生物安全要求
GB/T38740—2020
样品的采集、保存及运输过程中应做好相关人员生物安全保护，并符合GB/T18088的相关要求。样品的处理应在具有生物安全3级条件的实验室中进行，实验室条件符合GB19489要求。7.2取样工具
棉拭子、剪刀、镊子、离心管、一次性无菌注射器，上述取样工具应无菌。7.3血液样品
用无菌注射器直接吸取血液至1.5mL无菌抗凝离心管中，编号备用7.4肛拭子或者粪便
将灭菌的棉拭子插入肛门或者粪便中轻轻左右搅动，然后将拭子放人装有1.5mLPBS的离心管内，加盖、编号。棉拭子样品于旋涡振荡器上振荡混匀约5S后，于离心机中瞬时离心，立即使用或eikA
一20℃备用。
7.5内脏样品
用无菌的剪刀和镊子剪取待检动物的肝脏，肾脏、心脏或者脾脏约2.0g于组织匀浆器中，加人10mLPBS匀浆，然后将组织悬液转入无菌1.5mL离心管中3000g离心10min，取上清液转人另无菌1.5mL离心管中，编号备用。7.6存放和运送
采集或处理的样本在2℃～8℃条件下保存应不超过24h；若长期保存，应放置一70℃冰箱，避免反复冻融（最多冻融3次）。采集的样品密封后，采用保温壶或保温桶加冰密封，尽快运送到实验室。8试验步骤
8.1实验室生物安全要求
病原样本的检测应在生物安全3级条件的实验室中进行，实验室条件符合GB19489要求。8.2样本核酸提取
8.2.1在样本处理区进行。为防止RNA降解，所用试验用具及溶液应无RNA酶操作过程中应佩戴一次性橡胶或乳胶手套。
8.2.2取200μL病毒液或已处理好的样品加入到无RNA酶的1.5mL离心管中，加入600μLTrizol试剂.用旋涡振荡器剧烈振荡15s后，室温放置5min。8.2.3加人200uL三氯甲烷，用旋涡振荡器剧烈振荡15s后室温放置3min，4℃，12000g离心15min。
8.2.4吸取上清液转移至一个新的无RNA酶的1.5mL离心管中，加入500μL异丙醇，上下颠倒混GB/T38740—2020
匀，室温放置10min。
8.2.54℃，12000g离心15min，弃上清液，将离心管倒置于吸水纸上，将液体去除8.2.6加人1000μL预冷的75%乙醇，缓慢颠倒洗涤沉淀。8.2.74℃、12000g离心15min，弃上清液，将离心管倒置于吸水纸上，室温干燥沉淀5min~10 min。
8.2.8加人20μLDEPC水，溶解沉淀后，室温孵育10min。提取的RNA应在2h内使用或－70℃冰箱保存备用。
8.2.9在实验过程中，同时设置阴性对照和以DEPC水空白对照。8.2.10可采用同等效果的商业化RNA抽提试剂盒代替以上方法8.3反应体系
取出相应的荧光RT-PCR试剂、引物探针等，在室温下融化后，2000g离心5s。按样品数量配制反应液，每个反应管包含：10×RT-PCR缓冲液2μL，25mmol/LMgClz2μL，2.5mmol/LdNTPs1.5uL，10μmol/L上下游引物各1μL.10μmol/L探针0.5μL，5U/μLDNA聚合酶0.5μL，5U/μL逆转录酶0.5μL，40U/μLRNA酶抑制剂0.5μL，DEPC水6.5μL。充分混合均匀，向每个反应管中各分装16μL，转移至样本处理区，最后加人总RNA4μL。实时荧光PCR扩增可以采用等效的商品化荧光定量PCR试剂盒。8.4反应程序
50℃反转录30min；95℃预变性5min；95℃变性15s61℃退火30s，收集荧光，共32个循环同时设阳性对照、阴性对照和空白对照，记录Ct值。可根据不同仪器要求将反应程序做适当调整。iKae
8.5结果判定
8.5.1结果分析条件设定
综合分析仪器给出的各项结果，基线以仪器给出的默认值作为参考，阈值设定原则以阅值线刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点为准，具体根据仪器噪音情况进行调整，选择FAM通道进行分析。8.5.2质控标准
阳性对照样品有对数扩增曲线，而且Ct值≤28。阴性对照和空白对照无Ct值并且无扩增曲线。二者均成立才可判定试验成立。8.5.3结果描述及判定
检验样本Ct值≤28.且出现典型的扩增曲线，则判定MARV阳性检验样本2832时.则判定MARV阴性。4
A.10.01mol/LPBS
Na2HPO.:12H20
附录A免费标准下载网bzxz
（规范性附录）
试剂配方
GB/T38740—2020
将上述成分依次溶解，去离子水定容至终体积为1000mL，调pH至7.2,121℃高压灭菌20min，室温保存。
无RNase超纯水（DEPC水）
超纯水
焦炭酸二乙酯（DEPC）
室温过夜，121℃，15min灭菌，或直接购买无RNase超纯水。iiKaeer
75%乙醇
无水乙醇
无RNase超纯水
现配现用。
GB/T38740—2020
附录B
（资料性附录）
参考序列
实时荧光RT-PCR扩增的猴马尔堡病毒基因序列（共163bp）ttggtgcggacctccaaagtaaaaaatgaagttgctagtttcaagcaggcgttgagcaacctagcccgacatggagaatacgcaccatttgcacgggttctgaatttatcagggattaacaacctcgagcatggactctatcctcagctctcagcaattgcgciiikaeeikAca
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中华人民共和国国家标准
GB/T38740—2020
实验动物
猴马尔堡病毒检测方法
Laboratory animalMethod for examination of simian Marburg virus (MARV)2020-04-28发布
国家市场监督管理总局
国家标准化管理委员会
2020-08-01实施
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由全国实验动物标准化技术委员会（SAC/TC281)提出并归口。GB/T38740—2020
本标准起草单位：海南出入境检验检疫局检验检疫技术中心、中华人民共和国福州海关、中华人民共和国成都海关、中华人民共和国海口海关、中华人民共和国济南海关、北京脑科学与类脑研究中心、中华人民共和国海口海关、中华人民共和国昆明海关。本标准主要起草人：李丹丹、张体银、安微、王绥家、凌宗帅、李文龙、陈平亚、艾军。1
1范围
实验动物
猴马尔堡病毒检测方法
本标准规定了猴马尔堡病毒实时荧光RT-PCR检测的操作方法。本标准适用于猴马尔堡病毒的检测。2规范性引用文件
GB/T38740—2020
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T18088出入境动物检疫采样
GB19489实验室生物安全通用要求术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。3.1
Marburgvirus
马尔堡病毒
一种高致病性病毒，属丝状病毒科（Filoviridae），单股负链RNA病毒，基因组约19.1kb，为已知的最大的负链RNA病毒。
逆转录实时荧光聚合酶链式反应real-time quantitativereverse transcriptionpolymerase chainre-action;real-timeRT-PCR
将mRNA逆转录为cDNA后再作为模板进行实时荧光PCR扩增。PCR反应体系中加人一对引物的同时加入一条特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸片段，两端分别标记一个报告荧光基团和个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR特异性扩增时，Tag酶的5°-3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和萍灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。3.3
噪音noise
荧光PCR仪在仅仅使用PCR管和水的状态下的本底荧光强度。3.4
Ct值cycle threshold value
从基线到指数增长的拐点所对应的PCR反应循环次数。4缩略语
下列缩略语适用于本文件。
GB/T38740—2020
DEPC：焦碳酸二乙酯（diethylpyrocarbonate）dNTP：脱氧核苷三磷酸（deoxyribonucleosidetriphosphate）FAM：6-羧基荧光素（6-carboxy-fluorescein）MARV：马尔堡病毒（Marburgvirus）PBS：磷酸盐缓冲液（phosphate-bufferedsaline）RNA：核糖核酸(ribonucleicacid）RT-PCR：逆转录聚合酶链式反应（reversetranscriptionpolymerasechainreaction）SDS：十二烷基硫酸钠（sodiumdodecylsulfate）TAMRA：6-羧基四甲基若丹明（6-carboxytetramethylrhodamine）Taq酶：TagDNA聚合酶（TagDNApolymerase)Tris：三（羟甲基）氨基甲烷[tris(hydroxymethyl）aminomethane]5试剂或材料
本标准所用水应符合GB/T6682中一级水的规格要求5.1裂解液：Trizol或其他等效裂解液。5.2
三氯甲烷：异戊醇：体积比24：1。5.3
异丙醇：-20℃预冷。
磷酸盐缓冲液（PBS)：见附录A中的A.1。无RNase水：见A.2
75%乙醇：见A.3。
10XRT-PCR缓冲液。
dNTPs：含dCTP、dGTP、dATP、dTTP各2.5mmol/L。5.9
MgCl:25mmol/L
TaqQDNA聚合酶：一20℃保存，避免反复冻融或温度剧烈变化RNA酶抑制剂。
阳性对照：体外转录的、非感染性的、猴马尔堡病毒阳性RNA片段，DNA序列参见附录B阴性组织对照：猴马尔堡病毒阴性组织样品。5.15
引物和探针，浓度为10mol/L.序列如下：上游引物MARV-F:5-TTGGTGCGGACCTCCAAAGT-3；下游引物MARV-R:5-GCGCAATTGCTGAGAGCTGA-3：探针:5'-FAM-AGCAGGCGTTGAGCAACCTAGCCCGA-BHQI-3。6仪器设备
6.1荧光定量PCR核酸扩增仪。
2生物安全柜。
3电子天平。
6.4高速冷冻离心机，台式离心机。6.5
5冷藏冷冻冰箱。
6.6组织匀浆器。
旋涡振荡器。
6.8微量可调移液器：2μ、10μ、20μL、100μL、200μ、1000μ。6.9
低温冰箱，温度≤一70℃。
7样品采集
生物安全要求
GB/T38740—2020
样品的采集、保存及运输过程中应做好相关人员生物安全保护，并符合GB/T18088的相关要求。样品的处理应在具有生物安全3级条件的实验室中进行，实验室条件符合GB19489要求。7.2取样工具
棉拭子、剪刀、镊子、离心管、一次性无菌注射器，上述取样工具应无菌。7.3血液样品
用无菌注射器直接吸取血液至1.5mL无菌抗凝离心管中，编号备用7.4肛拭子或者粪便
将灭菌的棉拭子插入肛门或者粪便中轻轻左右搅动，然后将拭子放人装有1.5mLPBS的离心管内，加盖、编号。棉拭子样品于旋涡振荡器上振荡混匀约5S后，于离心机中瞬时离心，立即使用或eikA
一20℃备用。
7.5内脏样品
用无菌的剪刀和镊子剪取待检动物的肝脏，肾脏、心脏或者脾脏约2.0g于组织匀浆器中，加人10mLPBS匀浆，然后将组织悬液转入无菌1.5mL离心管中3000g离心10min，取上清液转人另无菌1.5mL离心管中，编号备用。7.6存放和运送
采集或处理的样本在2℃～8℃条件下保存应不超过24h；若长期保存，应放置一70℃冰箱，避免反复冻融（最多冻融3次）。采集的样品密封后，采用保温壶或保温桶加冰密封，尽快运送到实验室。8试验步骤
8.1实验室生物安全要求
病原样本的检测应在生物安全3级条件的实验室中进行，实验室条件符合GB19489要求。8.2样本核酸提取
8.2.1在样本处理区进行。为防止RNA降解，所用试验用具及溶液应无RNA酶操作过程中应佩戴一次性橡胶或乳胶手套。
8.2.2取200μL病毒液或已处理好的样品加入到无RNA酶的1.5mL离心管中，加入600μLTrizol试剂.用旋涡振荡器剧烈振荡15s后，室温放置5min。8.2.3加人200uL三氯甲烷，用旋涡振荡器剧烈振荡15s后室温放置3min，4℃，12000g离心15min。
8.2.4吸取上清液转移至一个新的无RNA酶的1.5mL离心管中，加入500μL异丙醇，上下颠倒混GB/T38740—2020
匀，室温放置10min。
8.2.54℃，12000g离心15min，弃上清液，将离心管倒置于吸水纸上，将液体去除8.2.6加人1000μL预冷的75%乙醇，缓慢颠倒洗涤沉淀。8.2.74℃、12000g离心15min，弃上清液，将离心管倒置于吸水纸上，室温干燥沉淀5min~10 min。
8.2.8加人20μLDEPC水，溶解沉淀后，室温孵育10min。提取的RNA应在2h内使用或－70℃冰箱保存备用。
8.2.9在实验过程中，同时设置阴性对照和以DEPC水空白对照。8.2.10可采用同等效果的商业化RNA抽提试剂盒代替以上方法8.3反应体系
取出相应的荧光RT-PCR试剂、引物探针等，在室温下融化后，2000g离心5s。按样品数量配制反应液，每个反应管包含：10×RT-PCR缓冲液2μL，25mmol/LMgClz2μL，2.5mmol/LdNTPs1.5uL，10μmol/L上下游引物各1μL.10μmol/L探针0.5μL，5U/μLDNA聚合酶0.5μL，5U/μL逆转录酶0.5μL，40U/μLRNA酶抑制剂0.5μL，DEPC水6.5μL。充分混合均匀，向每个反应管中各分装16μL，转移至样本处理区，最后加人总RNA4μL。实时荧光PCR扩增可以采用等效的商品化荧光定量PCR试剂盒。8.4反应程序
50℃反转录30min；95℃预变性5min；95℃变性15s61℃退火30s，收集荧光，共32个循环同时设阳性对照、阴性对照和空白对照，记录Ct值。可根据不同仪器要求将反应程序做适当调整。iKae
8.5结果判定
8.5.1结果分析条件设定
综合分析仪器给出的各项结果，基线以仪器给出的默认值作为参考，阈值设定原则以阅值线刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点为准，具体根据仪器噪音情况进行调整，选择FAM通道进行分析。8.5.2质控标准
阳性对照样品有对数扩增曲线，而且Ct值≤28。阴性对照和空白对照无Ct值并且无扩增曲线。二者均成立才可判定试验成立。8.5.3结果描述及判定
检验样本Ct值≤28.且出现典型的扩增曲线，则判定MARV阳性检验样本28
A.10.01mol/LPBS
Na2HPO.:12H20
附录A免费标准下载网bzxz
（规范性附录）
试剂配方
GB/T38740—2020
将上述成分依次溶解，去离子水定容至终体积为1000mL，调pH至7.2,121℃高压灭菌20min，室温保存。
无RNase超纯水（DEPC水）
超纯水
焦炭酸二乙酯（DEPC）
室温过夜，121℃，15min灭菌，或直接购买无RNase超纯水。iiKaeer
75%乙醇
无水乙醇
无RNase超纯水
现配现用。
GB/T38740—2020
附录B
（资料性附录）
参考序列
实时荧光RT-PCR扩增的猴马尔堡病毒基因序列（共163bp）ttggtgcggacctccaaagtaaaaaatgaagttgctagtttcaagcaggcgttgagcaacctagcccgacatggagaatacgcaccatttgcacgggttctgaatttatcagggattaacaacctcgagcatggactctatcctcagctctcagcaattgcgciiikaeeikAca
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