GA/T 383-2014.Specifications for examination of forensic DNA laboratory.
1范围
GA/T 383规定了法庭科学DNA实验室检验应遵守的基本要求。
GA/T 383适用于所有从事法庭科学检验的DNA实验室。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T27025--2008检测和校准实验室能力的通用要求
GA 765- 2008 人 血红蛋白检测金 标试剂条法
GA 766- -2008 人精液 PSA检测金标试剂 条法
3术语与定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1前期检验prior examination
DNA检验前进行的预试验和确证试验。
3.2DNA提取DNA extraction
将DNA分子从其蛋白及其他细胞物质成分中分离提纯的过程和方法。
3.3遗传标记genetie marker
由遗传决定,并能够以--定的规律从亲代传给子代的生物学特征。
3.4聚合酶链反应polymerase chain reaction;PCR
一个酶促的特定DNA片段体外扩增过程。
4前期检验
4.1血痕检验
4.1.1预检验
4.1.1.1联苯 胺试验
4.1.1.1.1试剂
联苯胺试剂配方如下:
a)联苯胺无水乙醇饱和液;
b) 3%过氧化氢溶 液;
c)冰醋酸。
配制方法见附录B.

ICS13.310
中华人民共和国公共安全行业标准GA/T383—2014
代替GA/T383—2002
法庭科学DNA实验室检验规范
Specifications for examination of forensic DNA laboratory2014-05-09发布
中华人民共和国公安部
2014-05-09实施
本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。GA/T383—2014
本标准代替GA/T383—2002《法庭科学DNA实验室检验规范》，与GA/T383—2007相比主要技术变化如下：
删除了定义“有机溶剂法”\Chelex法”“硅珠法”和“CTAB法”，将这部分内容移人正文中（见5.1、5.2、5.3和5.5，2002年版的2.2、2.3、2.4和2.5）；增加了“DNA提取”的术语和定义（见3.2）；一增加了遗传标记”的术语和定义（见3.3）；一删除了案件受理有关的内容（见2002年版的第3章）；删除了检材的提取和保存有关的内容（见2002年版的第4章）；删除了前期检验血痕检验种属试验一环状沉淀试验的有关内容（见2002年版的5.1.2）；删除了前期检验血痕检验种属试验一对流免疫电冰法的有关内容（见2002年版的5.1.3）；删除了前期检验血痕检验种属试验一金标试纸检验法的有关内容（见2002年版的5.1.4）；-增加了前期检验血痕检验预检验中鲁米诺检验的有关内容（见4.1.1.2）；增加了前期检验血痕检验确证检验中金标试纸检验法的有关内容（见4.1.2）：一删除了前期检验精斑检验中预检验一酸性磷酸酶试验的有关内容（见2002年版的5.2.1）；增加了前期检验精斑检验中确证检验一金标试纸检验法的有关内容（见4.2.2）；删除了前期检验唾液斑检验的有关内容（见2002年版的5.3）；删除了DNA提取PCR缓冲液处理法的有关内容（见2002年版的6.5）；将有机溶剂法，Chelex法、硅珠法和CTAB法的器材、试剂和方法有关内容入附录（见附录A，2002版的6.1、6.2、6.3和6.4)；增加了DNA提取与纯化中的方法种类（见5.4、5.6、5.7、5.8、5.9、5.10、5.11、5.12和附录A）；删除了DNA质和量的检测定量胶检测法的有关内容（见2002年版的7.2）；除了DNA质和量的检测人类DNA定量试剂盒的有关内容（见2002年版的7.3）；增加了DNA定量其他定量方法的有关内容（见6.3）：删除了PCR反应的有关内容（见2002版的第8章）；剧除了反应产物的检测的有关内容（见2002版的第9章）：增加了人类DNA性别及STR多态性分析的有关内容（见第7章）；删除了防污染措施、文档资料、检验周期的有关内容（见2002版的第11章、第12章和第13章）；一增加了常用试剂推荐配方（见附录B）。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由全国刑事技术标准化技术委员会（SAC/TC179）提出并归口。本标准主要起草单位：公安部物证鉴定中心。本标准参加起草单位：上海市公安局、广州市公安局、北京市公安局、天津市公安局。本标准起草人：叶健、周怀谷、刘超、赵兴春、陈松、刘雅诚、姜成涛、刘冰、匡金枝、张建、李彩霞、白雪。
本标准所代替标准的历次版本发布情况为：-GA/T383-2002.
1范围
法庭科学DNA实验室检验规范
本标准规定了法庭科学DNA实验室检验应遵守的基本要求。本标准适用于所有从事法庭科学检验的DNA实验室。规范性引用文件
GA/T383—2014
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T27025—2008检测和校准实验室能力的通用要求GA765—2008人血红蛋白检测金标试剂条法GA766—2008
金标试剂条法
人精液PSA检测
3术语与定义
下列术语和定义适用于本文件。3.1
前期检验priorexamination
DNA检验前进行的预试验和确证试验。3.2
DNAextraction
DNA提取
将DNA分子从其蛋白及其他细胞物质成分中分离提纯的过程和方法。3.3
geneticmarker
遗传标记
由遗传决定，并能够以一定的规律从亲代传给子代的生物学特征。3.4
聚合酶链反应polymerasechainreaction；PCR一个酶促的特定DNA片段体外扩增过程。4
前期检验
血痕检验
预检验
联苯胺试验
4.1.1.1.1
联苯胺试剂配方如下：
GA/T383—2014
联苯胺无水乙醇饱和液；
3%过氧化氢溶液；
c)冰醋酸。
配制方法见附录B，
2方法
4.1.1.1.2
取滤纸轻轻擦拭斑迹，分别加冰醋酸、联苯胺无水乙醇饱和液、3%过氧化氢溶液，立即出现翠蓝色为阳性反应。
鲁米诺检验
4.1.1.2.1试剂
鲁米诺试剂配方为：
a）鲁米诺粉末；
b）过氧化氢粉末，
4.1.1.2.2方法
按1*5比例，分别将鲁米诺粉末0.1g与过氧化氢粉末0.5g置喷壶中，加人100mL~200mL蒸馏水混合，喷酒斑迹，立即出现蓝色荧光为阳性反应。4.1.2
确证检验—金标试纸检验法
确证检验主要试剂如下：
a）人血红蛋白检测金标试纸条，纯水。
4.1.2.2方法
见GA765-2008。
精斑检验
确证检验——精子检出法
确证检验主要试剂如下：
1%酸性复红溶液；
1%美蓝溶液；
1%盐酸；
生理盐水。
2方法
取少量可疑斑迹用适量生理盐水浸泡后，离心取沉渣涂于载玻片上，干燥后分别用1%酸性复红溶液和1%美蓝溶液染色，1%盐酸和清水洗涤，干燥后镜检。精子头部被染成红色，而尾部被染成蓝色。2
2确证检验——金标试纸检验法
4.2.2.1试剂
确证检验主要试剂如下：
a）人前列腺特异性抗原检测金标试纸条，b）
纯水。
见GA766--2008。
5DNA提取与纯化
详见附录A。
5.1有机溶剂法
GA/T383-2014
通过酚-氟仿混合物萃取DNA溶液中的蛋白质类有机物质，保留DNA于水相溶液中的DNA提取2方法。
2聚苯乙烯二乙烯基苯树脂法
通过Chelex螯合镁、钠和钾等离子，使降解DNA的核酸酶失去活性的DNA提取方法。3硅珠法
在高浓度的硫氰酸胍存在的条件下，通过二氧化硅微粒特异捕获有机质溶液中DNA分子的DNA提取方法。
磁珠法
在胍盐存在条件下，通过在硅胶外表涂上一层磁性树脂的磁珠，特异性的吸附细胞裂解液裂解后释放出DNA的DNA提取与纯化方法。5十六烷基三甲基溴化胺法
通过非离子型去污剂CTAB破坏细胞壁和细胞膜及硬组织，并与DNA形成复合物，分离DNA与蛋白质及多糖类物质的DNA提取方法。5.6硅胶膜吸附法
通过硅胶膜吸附细胞裂解液裂解后释放出DNA，并经蛋白酶消化、漂洗液清洗除去蛋白质、脂质以及多糖等杂质的DNA提取与纯化方法。5.7FTA卡法免费标准bzxz.net
通过FTA卡裂解细胞释放DNA，从血液、口腔上皮细胞中获得DNA的方法。5.8全自动工作站法
采用全自动工作站结合上述提取、纯化方法进行DNA提取和纯化的方法。3
GA/T383—2014
乙醇沉淀纯化法
通过乙醇沉淀去盐，纯化DNA的方法。异丙醇沉淀纯化法
通过异丙醇去多糖、蛋白，纯化DNA的方法。其他商品化核酸提取和纯化试剂盒5.11
参照试剂盒说明书操作。
2自行开发的核酸提取和纯化方法5.12
应按照GB/T27025—2008的要求进行方法确认，DNA定量
6.1紫外分光光度计法
预置分光光度计零点。
充分混匀样品，读取260nm和280nm的OD值。6.1.3计算A260/A280比率，比率大于1.6表明DNA较纯。6.1.4计算DNA浓度：
单链DNA：1OD=40μg/mL；
双链DNA：1OD=50μg/mL；
DNA浓度（μg/μL)）=稀释倍数×A260X40μg/mL+1000μL。定量PCR仪定量
试剂和方法以说明书为准。
6.3其他定量方法
试剂和方法以说明书为准，
7人类DNA性别及STR（shorttandemrepeats）多态性分析7.1
器材及试剂
检验所用主要器材及试剂如下：全自动荧光分析仪及配套试剂
b）扩增仪；
移液器：
d）人类荧光标记STR复合扩增试剂盒（包括带有ABO分型及直接扩增）。试剂配制方法见附录B
7.2方法
人类荧光标记STR复合扩增试剂
7.2.1.1选用获得认证的商品化试剂盒或获得认证的直接扩增试剂盒。4
GA/T383—2014
7.2.1.2自行开发的试剂应按照GB/T27025—2008的要求经方法确认后方可使用于日常检案。7.2.2PCR扩增
7.2.2.1扩增反应体系及循环参数，以各试剂盒的说明书为准。7.2.2.2设置阳性对照和阴性对照。7.2.3PCR反应产物的荧光检测
使用全自动荧光分析仪进行检测。器材、试剂、检测方法和数据分析以各试剂盒的说明书为准。8人类线粒体DNA测序
人类线粒体DNA（mtDNA）的非编码区D环（D-Loop）含有两个变异率较高的高变区（HighVariableRegions，HVR)I和II，本标准针对该两个区域HVRI和HVRI的测序，其他的DNA测序可参照本标准执行。
8.1器材及试剂
检验所用主要器材及试剂如下：a）全自动荧光分析仪及配套试剂；b）扩增仪；
c)移液器；
PCR试剂：引物（D-Loop高变区I或高变区II)L1、H1、L2、H2(L2、H2的碱基序列范围比L1、d
HI小，并包含在LI、HI的范围内），dNTP，Taq酶，PCR缓冲液；PCR产物纯化试剂盒；
测序试剂盒。
试剂配制方法见附录B
8.2方法
8.2.1样本DNA的扩增Nested-PCR法8.2.1.1第一步扩增：25μL体系，取适量模板DNA.加人dNTP、引物L1和H1、PCR缓冲液、Taq酶、离心，PCR反应（反应参数根据具体引物的长度设定）。8.2.1.2第二步扩增：50μL体系，取少量第一步扩增产物，加人dNTP、引物L2和H2、PCR缓冲液、Tag酶，离心，PCR反应（反应参数根据具体引物的长度设定）。8.2.1.3骨、毛干的测序从第一步开始，血液等富含DNA检材的测序从第二步开始。8.2.2扩增产物的纯化
材料和方法以纯化试剂盒的说明书为准。8.2.3测序反应
材料和方法以测序试剂盒的说明书为准。8.2.4荧光测序
使用全自动荧光分析仪进行测序，器材、试剂和方法以各说明书为准。5
GA/T383—2014
结果分析
运用分析软件进行自动分析，以Anderson（1981）报道的线粒体DNA序列为标准序列，测得样本的碱基序列与其比对，得到该样本线粒体DNA高变区段碱基序列的特征，结合电泳图谱复核结果。3遗传学分析
线粒体DNAD-Loop区碱基序列为单倍型，进行遗传学数量分析时应依照单倍型基因频率统计进行计算。
计算公式：
P-2x,h=(1-Ex)n/(n-1)
式中：
X-—线粒体DNA单倍型在群体中的频率；P—群体中任意两个体线粒体DNA多态区序列相同的可能性；检测的样品数量；
h单倍型多样性。
其他商品化检测试剂盒
参照试剂盒说明书操作。
A.1有机溶剂法
器材和试剂
主要器材及试剂如下：
高速离心机；
水浴或干浴；
移液器；
细胞溶解缓冲液；
蛋白溶解缓冲液；
DNA提取缓冲液；
TNE缓冲液；
TE缓冲液；
5×精子提取液；
附录A
（规范性附录）
DNA的提取和纯化方法
纯化试剂盒（试剂和方法详见说明书）；CentriconTM-100;
饱和酚和氯仿：
无水乙醇和70%乙醇溶液；
NaCI或NaAc;
蛋白酶K，
A.1.2.1.1
A,1.2.1.2
A.1.2.1.3
A.1.2.1.4
取适量血液加人等体积细胞溶解缓冲液，混匀至透明。离心后去上清液，沉淀中加人蛋白溶解缓冲液勾浆。加人SDS和蛋白醇K，37消化4h以上GA/T383—2014
一次后，加1/10体积的NaCI或NaAc加人等体积的酚、酚和氯仿（1：1混合）、氯仿各提取溶液和2.5倍体积的冷无水乙醇混匀，得到团状的DNA沉淀。A.1.2.1.5
A.1.2.1.6
离心去上清液，沉淀中加人70%乙醇混匀。离心去上清液，晾干后加人TE缓冲液或纯水备用。混合斑
A.1.2.2.1剪碎带有精子的检材，加人适量TNE缓冲液，37C保温0.5h~1h，加人SDS和蛋白酶K，37℃保温2h左右消化女性上皮细胞。A.1.2.2.2
底部带孔离心管离心分离去除载体，并去除上清液，沉淀物用TNE洗涤离心数次。7
GA/T383—2014
沉淀物内加入5×精子提取液、蛋白酶K，置37℃消化3h~4h。A.1.2.2.3
A.1.2.2.4以下同A.1.2.1.4.A.1.2.1.5、A.1.2.1.6。A.1.2.3
A,1.2.3.1取少量组织（脑、肌肉等）加人适量蛋白溶解缓冲液进行匀浆。A.1.2.3.2加人SDS和蛋白酶K，37C消化4h~6h。A.1.2.3.3以下同A.1.2.1.4、A.1.2.1.5、A.1.2.1.6。A1.2.4毛干
A1.2.4.1将毛干剪成3mm~5mm长，无水乙醇、纯水、无水乙醇各冲洗一次，晾干后加人DTT、SDS、蛋白酶K、蛋白溶解缓冲液，37℃消化至完全溶解。A,1.2.4.2加入等体积的酚、酚：氯仿（1：1混合）、氯仿各抽提一次，加入1/10体积的NaCl或NaAc溶液和2.5倍无水乙醇，混合后一20℃冷冻1h以上。A.1.2.4.3离心去上清液，沉淀中加人70%乙醇混匀。A.1.2.4.4离心去上清液，晾干后加人TE缓冲液或纯水备用A,1.2,5骨和牙齿
A.1.2.5.1
以手术刀刮净骨骼和牙齿表面垢物，用温热纯水冲洗两次，紫外光照射1h，再用锤子将牙齿砸成粉末和用电钻取骨密质和骨松质，并将其用研磨器进一步磨碎。取适量骨或牙齿粉末，加入DNA提取缓冲液、蛋白酶K，于37℃消化过夜。A.1.2.5.2
A.1.2.5.3酚和氯仿提取，提取液置CentriconTM-100中离心浓缩后，加1/10体积的NaCI和2.5倍无水乙醇置一20℃冰箱过夜。
A.1.2.5.4离心去上清液，晾干加人TE缓冲液或纯水溶解，用纯化试剂盒纯化后备用。A.2
Chelex法
器材和试剂
主要器材及试剂如下：
高速离心机；
水浴或干浴；
移液器：
Chelex-100;
TNE缓冲液；
蛋白酶K；
纯水。
血液和血痕
A.2.2.1.1
取少量血液或血痕加人适量纯水，室温30min以上。A.2.2.1.2
离心后去上清液，沉淀中加人Chelex-100,56℃消化30min以上（干浴传热效果较水浴差，0
故采用干浴时，时间适当延长）。A.2.2.1.3煮沸8min以上，离心后置4℃冰箱内低温保存备用。A.2.2.2混合斑
GA/T383—2014
A.2.2.2.1剪碎带有精子的检材，加人适量TNE缓冲液，37℃保温0.5h1h，加人SDS和蛋白酶K，37℃保温2h左右消化女性上皮细胞。A.2.2.2.2底部带孔离心管离心分离去除载体，并去除上清液，沉淀物用TNE离心洗涤数次。沉淀物内加入Chelex-100溶液、蛋白酶K和DTT溶液，置56C消化2h左右。A.2.2.2.3
A.2.2.2.4煮沸8min以上，离心后置4C冰箱内低温保存备用。A.2.2.3
A.2.2.3.1
取少量组织（脑、肌肉等）加入适量蛋白溶解缓冲液进行匀浆。A.2.2.3.2加人Chelex-100、蛋白酶K，56消化2h~3h。3煮沸8min以上，离心后置4℃冰箱内低温保存备用。A.2.2.3.3
A.2.2.4睡液斑
信封和邮票用灭菌的双蒸水润湿的棉签涂抹信封封口处和邮票背面，烟蒂直接剪取外层纸，A.2.2.4.1
剪碎后加人Chelex-100、蛋白酶K，56℃消化1.5h以上A.2.2.4.2煮沸8min以上，离心后置4℃冰箱内低温保存备用。A.2.2.5毛发
A.2.2.5.1毛根剪取毛发的毛根部分5mm~10mm，毛干则剪成3mm~5mm长，无水乙醇、水、无水乙醇各冲洗一次，晾干后加人Chelex-100、蛋白酶K，DTT，56C消化至完全溶解。A.2.2.5.2煮沸8min以上，离心后置4C冰箱内低温保存备用。A.2.2.6
骨和牙齿
研碎的牙髓或骨髓，加入Chelex-100、蛋白酶K溶液，56℃消化过夜。A.2.2.6.1
A.2.2.6.2
煮沸8min以上，离心后置4C冰箱内低温保存备用。硅珠法
器材和试剂
主要器材及试剂如下：
高速离心机；
水浴或干浴；
移液器；
吸附液；
漂洗液；
硅珠悬液；
TES缓冲液；
十二烷基肌氨酸钠；
GA/T383—2014
蛋白酶K
无水乙醇和70%乙醇；
m）双蒸馏水。
血液和血痕
A.3.2.1.1
载体。
A.3.2.1.2
A.3.2.1.3
A.3.2.1.4
A.3.2.1.6
取少量血液和血痕，加人TES缓冲液和十二烷基肌氨酸钠，煮沸5min以上，血痕离心去加人吸附液，混和后加人硅珠悬液，混和后室温15min左右。离心去上清液，加人漂洗液，混合。离心去上清液，加人冷70%乙醇，混合，离心去上清液，加人TES，56℃保温10min以上。离心后置4℃冰箱内保存备用。
混合斑
A.3.2.2.1
A.3.2.2.2
剪碎带有精子的检材，加人适量TES缓冲液，SDS和蛋白酶K溶液，37℃消化2h左右。去载体，离心去上清液，TES缓冲液洗涤沉淀物数次。A.3.2.2.3
加人TES缓冲液和十二烷基肌氨酸钠，煮沸5min以上。离心后上清液按A.3.2.1.2~A3.2.1.6操作进行。A.3.2.2.4
毛发和指（趾）甲
A.3.2.3.1毛发或指（趾）甲分别用双蒸馏水和无水乙醇洗涤，剪碎后加人TES缓冲液、十二烷基肌氨酸钠和DTT溶液，56℃消化至完全溶解。A.3.2.3.2离心后上清液按A.3.2.1.2~A3.2.1.6操作进行。A.3.2.4骨和牙齿
A.3.2.4.1取适量骨或牙齿粉末（见有机溶剂提取法）分别用TES缓冲液和EDTA洗涤，加人TES缓冲液、十二烷基肌氨酸钠和蛋白酶K、DTT溶液，56消化过夜。A.3.2.4.2离心后上清液按A.3.2.1.2～A.3.2.1.6操作进行。A.4磁珠法
A.4.1器材和试剂
主要器材及试剂如下：
磁架；
旋涡振荡器；
干浴或水浴；
移液器；
磁珠试剂盒（试剂和方法详见说明书）；纯水，
A.4.2方法
取适量检材，加人适量裂解液95℃~100℃30min以上。
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