T/CAIA
中国分析测试协会标准
T/CAIA/SH005-2015
动物源性食品中肤喃唑酮代谢物3-氨基-2-唑酮的测定酶联免疫吸附法
Determination of furazolidone metabolite3-amino-2-oxalidinone residues in animal original foodEnzyme Iinked immunosorbent assay method2015-12-30发布
中国分析测试协
2016-04-01实施下载标准就来标准下载网
T/CAIA/SHO05-2015
本标准按照GB/T1.1-2009《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写》给出的规则起草。
本标准由中国分析测试协会标准化委员会提出并归口。本标准起草单位：北京勤邦生物技术有限公司本标准主要起草人：罗晓琴、朱亮亮、杨昌松、万宇平、贾芳芳、冯静、崔海峰、刘玉梅
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动物源性食品中肤唑酮代谢物3-氨基-2-赚唑酮的测定酶联免疫吸附法
1范围
本标准规定了动物源性食品中呋哺唑酮代谢物3氮基-2-暖唑丽（3-amino-2-oxalidinone，AOZ）的联免疫吸附（ELISA）测定方法，本标准适用于鸡肉、鸡肝、猪肉、猪肝。鱼肉、虾肉等动物源性食品中肤哨唑酮代谢物3-氮基-2-噜唑酮的测定。其他食品可参照执行本标准的方法检出限为0.10ug/kg。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件，凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单》适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规则和试验方法3原理和方法提要
本方法为间接竞争EISA方法。2-确基苯甲醛与试样中的3-氨基2-响唑酮反应生成3-(2-硝基芋叉氨基）-2-唑烷前（2-NP-AOZ），酶标板微孔中包被有2-NP-A0Z抗原，与试样中的2-NP-AOZ抗原特异性竞争抗2-NP-AOZ抗体，加入静标二抗，通过显色液进行显色，试样中2-NP-A02的含量与相对吸光度值成反比，用标仪测定450nm波长下吸光度，配合分析软件计算试样中映响唑酮代谢物的含量4试剂和材料
以下所用试剂，除特殊注明外均为分析纯试剂，水符合GB/T6682规定的一级水。4.1试剂
4.1.12-硝基苯甲醛（NOzC6HCHO）：纯度不小于98.00%。4.1.2甲醇（CHOH)。
4.1.3乙酸乙酯（CHCOOCH）。
4.1.4正已烷（CHCHCHCHCHCH)。4.1.5三水合磷酸氢二钾（K.HPO4-3HO)。4.1.6盐酸（HCD：p-118g/cm
4.1.7氢氧化钠（NaOH）。
4.1.8吐温-20CisHaO(CHO))
4.1.9二水合磷酸二氢钠（NaH,PO,2H,O）。4.1.10十二水合磷酸氢二钠（NazHPO-12HsO）4.L11过氧化豚（CO(NH2)2-H.O,)。4.1.12四甲基联苯胺盐酸盘（CiHoNz-2HCD4.1.13硫酸（Hzso4)：p-184g/cm。4.2溶液配制
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4.2.1衍生化试剂：称取15.10m2-销基苯甲醛，加10.00mL甲醇溶解，混勾。4.2.2
铸酸氧二钾溶液0.50molL：称取114.00g三水合磷酸氢二钾，加水定容至1000mL，盐酸溶液0.30molL：量取12.45mLp=1.18g/cm3的盐酸，加水定容至500ml，混4.2.4氢氧化销溶液1.00mol/L：称取4.00g氢氧化钠，加水定容至100mL，混匀。4.2.5磷酸盐缓冲液0.20molL：准确称取25.80g十二水合磷酸氨二钠、4.36g二水合硝酸二氢钠，量取5.00mL吐温-20，加水定容至500mL，pll值为7.2。于2C~8C避光能够保存1个月。
磷酸盐缓冲液0.02mol/L：用水将0.20moVL磷酸盐缓冲液（4.2.5）按9l体积比进行稀释，用于酶标板洗涤。于2℃~8℃避光能够保存1个月。4.2.7磷酸盐缓冲液0.10mo/L:准硝取12.90g十二水合磷酸氢二钠、2.18g二水合霸酸二氢销，加水定容至500mL，pH值为7.6.于2C-8℃避光能够保存1个月。磷酸盐缓冲液0.05molL：用水将0.10mo/L磷酸盐缓冲液（42.7）按1:1体积比进行4.2.8
稀释，用于鸡肉、猪肉、鱼肉和虾肉提取试样的溶解。于2C~8C避光能够保存1个月。4.2.9
磷酸盐缓冲液0.025mol/L：用水将0.10mol/L磷酸盐缓冲液（4.2.7）按3:1体积比进行稀释，用于鸡肝和猪肝提取试样的溶解。于2℃~8℃避光能够保存1个月。4.2.10
显色液：准确称取1.00g过氧化脲和3.00g四甲基联苯胺盐酸盐，加水定容至1000mL。4.2.11
硫酸2.0mo/L：准确量取11.1mLp-1.84gem的HSO，缓慢加入水中，冷却至室后，加水定容至100mL
4.3标准品
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3-(2-硝基苯叉氨基）-2-唑烷酮（CroHgNsO4）：纯度不小于99.00%，CAS：19687-73-1。4.4标准溶液配制
4.4.13-(2硝基芋叉氨基）2-唑烷酮标准储备液1.00mg/mL：用水作为溶剂，配制成1.00mg/mL的3-(2-硝基芋叉氨基）2-唑烷酮（2-NP-AOZ）标准储备液，于-20℃避光条件下能够保存12个月
4.4.23-(2-硝基芋叉氮基）2-唑烷酮标准工作溶液：用0.05molL磷酸盐缓冲液（4.2.8）将1.00mg/mL的3-(2-硝基叉氮基）2-唑烷酮（2-NP-AOZ）标准储备液（4.4.1）配制成浓度分别为0g/L、25ng/L、75ng/L、225g/L、675ngL、2025ngL的2-NP-AOZ标准工作溶液。于2C~8C避光能够保存12个月。
4.5肤哺唑酮代谢物残留酶联免疫检测试剂盒构成（技术要求参见附录A1）4.5.1酶标微孔板：96孔，包被有2-NP-AOZ联抗原。4.5.2抗体：抗2-NP-AOZ特异性单克隆抗体4.5.3酶标二抗：羊抗飘免疫球蛋白与辣根过氧化物酶的结合物5仪器和设备
5.1酶标仪：内置450mm和630mm滤光片，检测暖光度5.2氛气吹干装置。
5.3勾浆机：转速不小于10000rmin5.4振劳器。
5.5涡旋仪。
5.6离心机：转速不小于3000/mm5.7恒温培养箱。
5.8天平：感量0.00001g0.01g
5.9微量移液器：单道20L~200
100~1000，多道250
6样品制备与保存
取新鲜或解冻的鸡肉、鸡肝、猪肉、猪肝、鱼肉、虾肉样品，剪碎，于10000r/min勺浆1mine
制备好的样品，应即刻进行提取和检测注：鱼、虾壳应去除。
7试样提取