本标准规定了椰毒假单胞菌酵米面亚种检验的基本要求、操作程序和结果判定。本标准适用于酵米面、变质鲜银耳及其他淀粉类发酵食品引起食物中毒的病因学诊断及椰毒假单胞菌酵米面亚种的常规检验及菌种鉴定。 GB/T 4789.29-2003 食品卫生微生物学检验 椰毒假单胞菌酵米面亚种检验 GB/T4789.29-2003 标准下载解压密码：www.bzxz.net

ICS07.100.30
中华人民共和国国家标准
GB/T4789.292003
代替GB/T4789.29-1994
食品卫生微生物学检验
椰毒假单胞菌酵米面亚种检验
Microbiological examination of foodhygieneExamination of Pseudomonas cocovenenans subsp. farinofermentans2003-08-11发布
2004-01-01实施
中华人民共和国卫生部
中国国家标准化管理委员会
GB/T4789.29—2003
本标准对GB/T4789.29—1994《食品卫生微生物学检验修订。
本标准与GB/T4789.29-—1994相比主要修改如下：毒假单胞菌酵米面亚种检验》进行按照GB/T1.1一2000对标准文本的格式和文字进行修改。规范原标准中的“设备和材料”。本标准自实施之日起，GB/T4789.29—1994同时废止。本标准由中华人民共和国卫生部提出并归口。本标准起草单位：中国疾病预防控制中心营养与食品安全所。本标准主要起草人，刘秀梅、白竞玉、付萍、杨宝兰。本标准于1994年首次发布，本次为第一次修订。234
1范围
食品卫生微生物学检验
椰毒假单胞菌酵米面亚种检验
GB/T4789.29—2003wwW.bzxz.Net
本标准规定了椰毒假单胞菌酵米面亚种检验的基本要求、操作程序和结果判定。本标准适用于酵米面、变质鲜银耳及其他淀粉类发酵食品引起食物中毒的病因学诊断及椰毒假单胞菌酵米面亚种的常规检验及菌种鉴定。2
规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T4789.28食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂GB/T11675银耳卫生标准
3设备和仪器
3.1冰箱：4℃~-20℃。
3.2恒温培养箱：26℃土1℃、36℃士1℃。3.3恒温水浴锅：46℃土1℃。
3.4显微镜：10×~100×。
3.5离心机：4000r/min。
3.6架盘药物天平：0g~500g，精度0.5g。3.7锥形瓶：100mL、500mL。
3.8灭菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）。3.9灭菌平Ⅲ：直径90mm，120mm。3.10
灭菌试管：16mm×160mm。
离心管：30mmX100mm。
小试管：10mm×100mm。
灭菌L形玻璃棒。
灭菌透明玻璃纸、滤纸。
灌胃器：1mL。
3.16小白鼠：18g~20g。
4培养基和试剂
4.1革兰氏染色液：按GB/T4789.28配制。4.2氧化酶试验：按GB/T4789.28执行。4.3马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）：按GB/T4789.28配制。4.4马铃薯葡萄糖半固体琼脂：按4.3PDA配方，琼脂量减至0.5g/100mL。4.5马铃薯葡萄糖水（PD水）：按4.3PDA配方，不加琼脂。235
GB/T 4789.29--2003
4.6GVC增菌液（椰毒假单胞菌酵米面亚种增菌用）：在高压灭菌的PD水（4.5）中，以无菌手续加龙胆紫水溶液（最终浓度为1/10万）氯藓索水溶液（最终浓度为20μg/mL）混匀、分装后置4℃备用。4.7卵黄琼脂：按GB/T4789.28配制。4.8SS琼脂：按GB/T4789.28配制。4.9Hugh-Leifson培养基（O/F试验用）：按GB/T4789.28配制。4.10
强白陈水（靛基质试验用）：按GB/T4789.28配制。缓冲葡萄糖蛋白陈水（MR和VP试验用）：按GB/T4789.28配制。西蒙氏柠檬酸盐培养基：按GB/T4789.28配制。苯丙氨酸培养基：按GB/T4789.28配制。糖发酵管：按GB/T4789.28配制。半固体琼脂：按GB/T4789.28配制。抗O多价血清、型特异性因子血清(O-Ⅲ、O-V、0V、OV、O-И型、O-殖型)。检验程序
椰毒假单胞菌酵米面亚种检验程序见图1。检样
淀粉类食品25g+225mLGVC增菌液鲜银耳1g+20mLGVC增荫液
36℃±148h
PDA平板
36℃±
苹兰氏染色
血清分型
氧化醇试验
24h48h
卵黄琼脂
36℃±i
PDA斜面
36℃±1℃
生化试验
24h48h
SS琼脂平板
产毒试验
米醇菌酸测定
6操作步骤
GB/T4789.29-—2003
用无菌操作取样品25g，加人盛有225mL增菌液的锥形瓶中（鲜银耳样品取1g，用剪刀剪碎，加人盛有20mL增菌液的锥形瓶中)36℃土1℃培养48h。6.2分离、纯化培养
取增菌液一接种环，划线接种PDA平板，36℃士1℃培养24h～48h。观察平板上生长菌落的形态，挑取可疑单个菌落，进行革兰氏染色及氧化酶试验。革兰氏染色阴性，氧化酶试验阴性的菌落再点种卵黄琼脂平板及SS琼脂平板，36℃士1℃分别培养48h和24h。椰毒假单胞菌酵米面亚种在不同分离平板上的菌落特征见表1。
表1椰毒假单胞菌酵米面亚种在不同分离平板上的菌落特征培养基
PDA平板
卵黄琼脂平板
SS琼脂平板
菌落特征
菌落1mm~2mm，灰白或乳白色，光滑、湿润、边缘整齐。培养48h后，中心有凸起，呈草帽状，菌落周固有黄绿色素扩散到基质中菌落表面光滑、湿润，48h后，菌落周围形成乳白色混浊环，斜射日光下可见环的表面呈虹彩现象
不生长
从卵黄琼脂平板上挑取卵磷脂酶阳性，并带有虹彩环的单个菌落，接种PDA斜面，36℃土1℃培养24h，供下步试验用。
6.3生化试验
从纯培养的PDA斜面上挑取少量菌苔，分别接种Hugh-Leifson培养基、蛋白陈水、缓冲蛋白陈水、西蒙氏柠檬酸盐培养基、糖发酵管及苯丙氨酸培养基，36℃士1℃培养，按单项试验的要求分别进行观察。椰毒假单胞菌酵米面亚种生化性状见表2。表2椰毒假单胞菌酵米面亚种生化性状阳
O/F试验（O型）
葡萄糖
半乳精
阿拉伯糖
甘露醇
卫茅醇
硝酸盐还原
6.4血清学分型监定
6.4.1O抗原的制备
明胶液化
卵磷脂酶
侧金盏花醇
柠橼酸盐利用
精氨酸
石蕊牛乳
37生长
氧化酶
靛基质
H,S产生
5℃不生长
41℃不生长
将马铃薯葡萄糖琼脂（PDA)斜面36℃士1℃，24h培养物用灭菌生理盐水洗下，煮沸2h，离心弃上清液，再用灭菌生理盐水稀释至5亿/mL～10亿/mL菌悬液，作为凝集试验用抗原。6.4.20抗原的鉴定
用多价血清做玻片凝集试验，同时用生理盐水做对照。与多价血清凝集者，依次用OⅢ、O-IV、0237
GB/T4789.29--2003
V、O-M、O-I型、O-型因子血清做试管凝集试验。根据试验结果，判定O抗原型。在生理盐水中自凝者不能分型。生化学性状符合，但不能与以上血清凝集者，需保留菌株做进一步的鉴定。6.5毒性试验
6.5.1产毒培养
取已鉴定为椰毒假单胞菌酵米面亚种的菌株接种PDA斜面，36℃士1℃，培养24h，加人3mL灭菌生理盐水，制成约100亿/mL的菌悬液，用无菌吸管吸取0.5mL，滴在铺好灭菌玻璃纸的半固体PDA平板上，用灭菌L形玻璃棒涂布均匀，26℃士1℃培养5d。敢下带菌的玻璃纸，将半固体平板放人消毒锅内，100℃流动蒸气灭菌30min。室温冷却后，置一10℃～20℃冰箱过夜。将冰冻好的半固体平板置室温融化，用灭菌吸管取出冻融液，经滤纸过滤放灭菌试管或锥形瓶中，4℃避光保存。此为粗毒素。
6.5.2毒力测定
取粗毒素或经水浴蒸发的5倍～10倍浓缩液0.5mL，灌胃小白鼠三只，体重18g～20g，观察7d。若菌株产生米酵菌酸，小鼠在灌胃后20min～24h内发病、死亡。主要症状为竖毛，萎糜不振，继而躁动，行步跨珊、肢体麻痹、瘫软、抽摘，呈角弓反张状，呼吸急促、死亡。6.5.3米酵菌酸测定
按照GB/T11675执行。
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