本标准规定了谷物和大豆中赭曲霉毒素A的薄层色谱测定方法。本标准适用于小麦、玉米和大豆中赭曲霉毒素A的测定。本方法的检出限为10μg/kg。 GB/T 5009.96-2003 谷物和大豆中赭曲霉毒素A的测定 GB/T5009.96-2003 标准下载解压密码：www.bzxz.net

ICS67.040
中华人民共和国国家标准
GB/T5009.96—2003
代替GB/T13111--1991
谷物和大豆中曲霉毒素A的测定
Determination of ochratoxin A in cereals and soybeans2003-08-11发布
中华人民共和国卫生部
中国宝家标化管理委员会
2004-01-01实施
GB/T5009.96—2003
本标准代替GB/T13111—1991《谷物和大豆中赭曲露毒素A的测定方法》。本标准与GB/T13111—1991相比主要修改如下：修改了标准的中文名称，标准中文名称改为《谷物和大豆中曲霖毒素A的测定》按GB/T20001.4—2001《标准编写规则第4部分：化学分析方法》对原标准的结构进行了修改。
本标准由中华人民共和国卫生部提出并归口。本标准起草单位：卫生部食品卫生监督检验所、辽宁省食品卫生监督检验所、黑龙江省食品卫生监督检验所、北京市卫生防疫站、山西省卫生防疫站。本标准主要起草人：魏润蕴、鲍风珍、方晓明、杨貌端、高晓岚。原标准于1991年首次发布，本次为第一次修订。682
1范围
谷物和大豆中赭曲霉毒素A的测定本标准规定了谷物和大豆中赭曲霉毒素A的薄层色谱测定方法。本标准适用于小麦、玉米和大豆中赭曲舞毒索A的测定。本方法的检出限为10μg/kg。
2规范性引用文件
GB/T5009.96—2003
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T5009.22-2003食品中黄曲舞毒素B的测定3原理
用三氮甲烷-0.1mo1/L磷酸或石油醚-甲醇/水提取试样中的赭曲霉毒素A，试样提取液经液-液分配后，根据其在365nm紫外光灯下产生黄绿色荧光，在薄层色谱板上与标准比较测定含量。4试剂
4.1石油醚（60℃~90℃或30℃～60℃）。4.2甲醇。
4.3三氮甲烷。
4.4甲苯。
4.5乙酸乙酯。
4.6甲酸。
4.7冰乙酸。
4.8乙醚。
4.9苯-乙睛（98+2)。
4.100.1mol/L磷酸Lc(H,PO,）=0.1mol/L]：称取11.5g磷酸（85%)加水稀释至1000mL。4.112mol/L盐酸溶液Lc(HCI)=2mol/L]：量取20mL盐酸，加水稀释至120mL。4.12氯化钠溶液（40g/L）)。
4.130.1mol/L碳酸氢钠溶液Lc(NaHCO）=0.1mol/L：称取8.4g碳酸氢钠，加适量水溶解，并用水稀释至1000mL。
4.14硅胶G：薄层层析用。
4.15赭曲舞毒素A标准品（以下简称OA)。4.16赭曲毒素A标准溶液：
4.16.1赭曲番毒素A标准贮备液：用苯-冰乙酸（99+1）配成40ug/mL赭曲舞毒素A标准备液，并用紫外分光光度计测定其浓度。浓度的测定按照GB/T5009.22—2003中3.14（赭曲霉毒素A的最大吸收峰波长333nm，分子量403，克分子消光系数值为5550）。置冰箱中避光保存。4.16.2赭曲霉毒素A标准使用液：精密吸取贮备液，用苯稀释成每毫升含赭曲篝毒素A0.5μg，置冰箱中避光保存。
GB/T5009.96—2003
5仪器
所有玻璃仪器均需用稀盐酸浸泡，用自来水、蒸馏水冲洗。5.1小型粉碎机。
5.2电动振荡器。www.bzxz.net
5.3玻璃板：5cmX20cm。
5.4薄层涂布器。
5.5展开槽：内长25cm、宽6cm、高4cm。5.6紫外光灯：365nm。
5.7微量注射器：10uL，50μL。5.8具0.2mL尾管的10mL小浓缩瓶。6分析步骤
6.1试样的制备
称取250g试样经粉碎并通过20目筛后备用。6.2提取
6.2.1甲法
称取约20g试样，精确至0.001g，置于200mL具塞锥形瓶中，加人100mL三氯甲烷和10mL0.1mol/L磷酸，振荡30min后通过快速定性滤纸过滤，取20mL滤液置于250mL分液漏斗中，加50mL0.1mol/L碳酸氢钠溶液振摇2min，静置分层后，将三氯甲烷层放人另一个100mL分液漏斗中（少量乳化层，或即使三氯甲烷层全部乳化都可放人分液漏斗中），加人50mL0.1mol/L碳酸氢钠溶液重复提取三氯甲烷层，静置分层后弃去三氯甲烷层（如三氯甲烷层仍乳化，弃去，不影响结果）。碳酸氢钠水层并人第一个分液漏斗中，加约5.5mL2mol/L盐酸溶液调节pH2~3（用pH试纸测试），加入25mL三氯甲烷振摇2min，静置分层后，放三氯甲烷层于另一盛有100mL水的250mL分液漏斗中，酸水层再用10mL三氯甲烷振摇、提取、静置，将三氯甲烷层并人同一分液漏斗中。振摇、静置分层，用脱脂棉擦于分液漏斗下端，放三氯甲烷层于一75mL蒸发血中，将蒸发血置蒸气浴上通风挥干。用约8mL三氟甲烷分次将蒸发血中的残渣溶解，转人具尾管的10mL浓缩瓶中，置80℃水浴锅上用蒸汽加热吹氮气（N，）浓缩至干，加入0.2mL苯-乙睛（98+2）溶解残渣，摇勾，供薄层色谱点样用。6.2.2乙法
称取20g粉碎并通过20目筛的试样加于200mL具塞锥形瓶中，加30mL石油醚和100mL甲醇-水（55十45），在瓶塞上抹上一层水盖严防漏。振荡30min后，通过快速定性滤纸滤人分液漏斗中，待下层甲醇-水层分清后，取出20mL滤液置于100mL分液漏斗中，用pH试纸测试，一般为pH5～6。加人25mL三氯甲烷振摇2min，静置分层后放出三氯甲烷层于另一分液漏斗中，再用10mL三氯甲烷重复振摇提取甲醇-水层（在用三氟甲烷振摇提取时，如发生乳化现象，可滴加甲醇促使其分层），将三氯甲烷层合并于同一分液漏斗中，加人50mL～100mL氯化钠溶液（4.12）（加人量视品种不同而异，大豆加100mL，小麦、玉米则加50mL左右），振摇放置（如为大豆试样提取液还须轻轻反复倒转分液漏斗，使乳化层逐渐上升。如乳化严重可加入少许甲醇），待三氰甲烷层澄清后，用脱脂棉擦干分液漏斗下端，放三氯甲烷层于75mL蒸发皿中（如为大豆试样须再加入10mL三氟甲烷振摇，三氯甲烷层合并于同一蒸发Ⅲ中)，将蒸发Ⅲ置蒸汽浴上通风挥干。以下操作自“用约8mL三氮甲烷分次将蒸发血中的残渣溶解”起，按甲法操作。
6.3测定
6.3.1薄层板的制备
称取4g硅胶G，加约10mL水于乳钵中研磨至糊状。立即倒人涂布器内制成5cm×20cm，厚度684
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0.3mm的薄层板三块，在空气中干燥后，在105℃～110℃活化1h，取出放干燥器中保存。6.3.2点样
取两块薄层板，在距薄层板下端2.5cm的基线上用微量注射器滴加两个点：在距板左边缘1.7cm处滴加OA标准溶液8μL（浓度0.5μg/mL），在距板左边缘2.5cm处滴加样液25μL，然后在第二块板的样液点上加滴OA标准溶液8μL（浓度0.5μg/mL）。点样时，箫边滴加边用电吹风吹干，交替使用冷热风。
6.3.3展开
6.3.3.1展开剂
横展剂：乙醚或乙醚-甲醇-水(94+5+1)。纵展剂：
a）甲苯-乙酸乙酯-甲酸-水（6+3+1.2+0.06)或甲苯-乙酸乙酯-甲酸（6+3+1.4)；b）苯-冰乙酸（9+1）。
6.3.3.2展开
横向展开在展开槽内倒入10mL横展剂，先将薄层板纵展至离原点2cm~3cm，取出通风挥发溶剂1min～2min后，再将该薄层板靠标准点的长边置于同一展开槽内的溶剂中横展，如横展剂不够，可添加适量，展至板端过1min，取出通风挥发溶剂2.min～3min。纵向展开：在另一展开槽内倒入10mL纵展剂，将经横展后的薄层板纵展至前沿距原点13cm~15cm。取出通风挥干至板面无酸味（约5min~10min）。6.3.4观察与评定
将薄层色谱板置365nm波长紫外光灯下观察。a）在紫外光灯下将两板相互比较，若第二块板的样液点在OA标准点的相应处出现最低检出量，而在第一板相同位置上未出现荧光点，则试样中的OA含量在本测定方法的最低检测量10μg/kg以下。
b）如果第一板样液点在与第二板样液点相同位置上出现荧光点则看第二板样液的荧光点是否与滴加的标准荧光点重叠，再进行以下的定量与确证试验。6.3.5稀释定盘
比较样液中OA与标准OA点的荧光强度，估计稀释倍数。薄层板经双向展开后，当阳性样品中OA含量高时，OA的荧光点会被横向拉长，使点变扁，或分成满个黄绿色荧光点。这是因为在横展过程中原点上OA的量超过了硅胶的吸附能力，原点上的杂质和残留溶剂在横展中将OA点横向拉长了，这时可根据OA黄绿色荧光的总强度与标准荧光强度比较，估计需减少的滴加微升数或所需稀释倍数。经稀释后测定含量时可在样液点的左边基线上滴加两个标准点，OA的量可为4ng、8ng。比较样液与两个标准0A荧光点的荧光强度，概略定量。6.3.6确证试验
用碳酸氢钠乙醇溶液（在100mL水中溶解6.0g碳酸氢钠，加20mL乙醇）喷酒色谱板，在室温下干燥，于长波紫外光灯下观察，这时OA荧光点应由黄绿色变为蓝色，而且荧光强度有所增加，可使方法检出限达5ug/kg，但概略定量仍按喷洒前所显黄绿色荧光计。7结果计算
XD×1000
式中：
X—试样中赭曲霉毒素A的含量，单位为微克每千克（μg/kg）；mi—薄层板上测得样液点上OA的量，单位为微克（μg)；685
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D样液的总稀释倍数：
V,苯-乙睛混合液的体积，单位为毫升(mL)V。出现最低荧光点时滴加样液的体积，单位为毫旁升（mL）一苯-乙溶解时相当样品的质量，单位为克（g）。m
8精密度
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的20%。686
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