ICS 65.020.30 B41 DB32 江苏省地方标准 DB32/T 1770—2011 A群猪轮状病毒的检测 RT-PCR方法 Method of RT-PCR for Detecting Porcine Rotavirus Group A 2011-05-06 发布 2011-07-06 实施 发布单位：江苏省质量技术监督局 前言 为规范A群猪轮状病毒分子生物学检测技术，提高检测的灵敏度、稳定性和特异性，特制定本标准。 本标准按 GB/T 1.1—2009《标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写》编写。 本标准附录A为规范性附录。 本标准由江苏省农业科学院提出。 本标准起草单位：江苏省农业科学院。 主要起草人：倪艳秀、何孔旺、郭容利、温立斌、昌立新、张雪寒、周俊明、李成仁、俞正玉、茅爱华、李彬、王小敏。 1 范围 本标准规定了A群猪轮状病毒RT-PCR检测方法的仪器设备、主要试剂、引物、操作步骤、结果判定、废弃物处理及防污染措施等技术要求。 本标准适用于A群猪轮状病毒的RT-PCR检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件；凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有修改单）适用于本文件。 GB 16548—2006 病害动物和病害动物产品生物安全处理规程 GB/T 6682—2008 分析实验室用水规格和试验方法 NY/T 541—2002 动物疫病实验室检验采样方法 3 原理 RT-PCR是将RNA的反转录（RT）与cDNA的聚合酶链式反应（PCR）相结合的技术。首先在反转录酶作用下由RNA合成cDNA，再以cDNA为模板进行PCR扩增，获得目标片段。 本方法根据GenBank公布的A群猪轮状病毒（PRV）衣壳蛋白VP7基因序列，在其保守区域设计特异性引物。提取待检样品RNA后，以引物进行反转录生成cDNA，再进行PCR扩增检测。 4 仪器设备和主要试剂 4.1 仪器设备 4.1.1 高速离心机 4.1.2 PCR仪 4.1.3 核酸电泳仪 4.1.4 凝胶成像系统 4.2 主要试剂 除另有规定外，所有试剂均为分析纯。 4.2.1 DEPC水（无RNA酶水） 4.2.2 TRIzol试剂 4.2.3 RNA酶抑制剂 4.2.4 AMV反转录酶 4.2.5 Taq DNA聚合酶 4.2.6 dNTP混合液 4.2.7 琼脂糖（电泳级） 5 引物 上游引物：5'-GTATGGTATTGAATATACCAC-3' 下游引物：5'-GATCCTGTTGGCCATCC-3' 6 方法步骤 试验用水应符合 GB/T 6682—2008 三级水标准。 6.1 样品处理 6.1.1 粪便样品处理 按照 NY/T 541—2002 要求采集腹泻猪粪便。按1:10比例加入DEPC水，充分振荡混匀后，以5000 r/min 离心20 min，取上清于-20 ℃保存。样品反复冻融3次后再次离心取上清。 阴性对照：健康猪粪便； 阳性对照：感染A群猪轮状病毒的猪粪便。 对照样品与检测样品同样处理，并编号标记。同时按 GB 16548—2006 要求对样品进行生物安全处理。 6.1.2 细胞培养物样品处理 可疑细胞培养物反复冻融3次后，以5000 r/min 离心20 min，取上清。 阴性对照：正常MA104细胞； 阳性对照：A群猪轮状病毒感染细胞培养物。 6.2 RNA提取 取200 μL样品上清，加入800 μL TRIzol试剂，混匀后室温放置5 min；加入200 μL氯仿，剧烈振荡后静置10 min，在4 ℃条件下以12000 r/min离心10 min。取上清，加入0.5 mL异丙醇混匀，-20 ℃放置2 h以上。 在4 ℃条件下以12000 r/min离心15 min，弃去上清，用1 mL 75%无RNA酶乙醇洗涤沉淀，7500 r/min离心5 min。弃去上清，室温干燥RNA沉淀约20 min，加入适量DEPC水溶解，-20 ℃保存备用。 6.3 RT-PCR 6.3.1 反转录反应 按20 μL反应体系进行：5×缓冲液4.0 μL，dNTP（10 mmol/L）2.0 μL，下游引物（50 pmol/μL）1.0 μL，RNA酶抑制剂0.5 μL，RNA模板12.0 μL，AMV反转录酶0.5 μL。混匀后进行反应：65 ℃ 15 min，42 ℃孵育1 h，95 ℃ 5 min。 同时设置阴性和阳性对照，反应产物于-20 ℃保存备用。