ICS 65.120
B 46
DB41
河南省地方标准
DB41/T 1586-2018

饲料中志贺氏菌的检测
EMA-PCR法

2018-04-17 发布
2018-07-17 实施
河南省质量技术监督局 发布

前言
本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。
本标准由河南省畜牧局提出并归口。
本标准起草单位：河南省兽药饲料监察所、郑州中道生物技术有限公司。
本标准主要起草人：高延玲、李金磊、狄元冉、董鹏、孟伟、刘素梅、曲登峰。
本标准参加起草人：方忠意、刘占通、刘素梅、韩楠、张杰、巩丹、王乐、范念亭、张艳娜、张崇威、王丽、孟祥。

1 范围
本标准规定了饲料中志贺氏菌的EMA-PCR检测方法。
本标准适用于饲料中志贺氏菌的检测。

2 规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
GB/T 8381.2 饲料中志贺氏菌的检测方法
GB/T 14699.1 饲料采样

3 原理
叠氮溴化乙锭（EMA）能够透过死细菌的细胞膜，在强光照射下可与其DNA发生不可逆转的结合，使死细菌DNA不能作为模板进行PCR扩增，而活菌能进行PCR扩增。

4 试剂和材料
4.1 除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂，试验用水符合GB/T 6682 二级水的要求。
4.2 GN增菌液：见附录A的A.1。
4.3 2×Premix Taq缓冲液：内含Taq DNA聚合酶1.25 U/25 μL，4 mmol/L Mg²⁺，dNTP各0.4 mmol/L。
4.4 特异性引物（对）序列为：
a) 上游引物：5'-TTGCTGCTGATGCCACTGAGA-3'
b) 下游引物：5'-CCAGAGGGAGAACCAGTCCTTA-3'
4.5 琼脂糖：电泳级。
4.6 Marker 2000。
4.7 志贺氏菌 ATCC 12022。
4.8 50×TAE缓冲液：见附录A的A.2。
4.9 6×上样缓冲液：见附录A的A.3。
4.10 叠氮溴化乙锭（EMA，0.2 mg/mL）：见附录A的A.4。
4.11 溴化乙锭（10 mg/mL）。
4.12 灭菌离心管：1.5 mL，15 mL。

5 仪器设备