ICS65.120 B46 DB41 方标准 河南省地 DB41/T15902018 饲料中阪崎肠杆菌的检测EMA-PCR法2018-04-17发布 河南省质量技术监督局 2018-07-17实施 发布 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准由河南省畜牧局提出并归口。本标准起草单位：河南省兽药饲料监察所、河南中标检测服务有限公司。DB41/T1590—2018 本标准主要起草人：张发旺、董鹏、郑洪、狄元冉、方忠意、刘传辉、杜红鸽。本标准参加起草人：高延玲、李金磊、李华岑、柴磊、巩丹、郑彬、朱雷、贾松涛、韩楠、藏合英、徐坤、杨希祥。 I 1范围 饲料中阪崎肠杆菌的检测EMA-PCR法本标准规定了饲料中阪崎肠杆菌的EMA-PCR检测方法。本标准适用于饲料中阪崎肠杆菌的检测。2规范性引用文件 2 DB41/T1590—2018 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB4789.40食品安全国家标准食品微生物学检验克罗诺杆菌属（阪崎肠杆菌）检验GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T14699.1饲料采样 原理 3 叠氮化乙锭（EMA）能够透过死细菌的细胞膜，在强光照射下可与其DNA发生不可逆转的结合，使死细菌DNA不能作为模板进行PCR扩增，而活菌能进行PCR扩增、4试剂和材料 4.1除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂，试验用水符合GB/T6682一级水的要求。4.2缓冲蛋白陈水（BPW）：见附录A的A.1。4.3改良月桂基硫酸盐胰蛋白陈肉汤-万古霉素（mLST-Vm）：见附录A的A.2。4.42×PremixTaq缓冲液：内含TaqDNA聚合酶1.25U/25μL，4mmolMg，dNTP各0.4mmol。4.5特异性引物（对）序列为： a）上游引物：5-CTGCTCTGCTGACGAGTGG-3；b）下游引物：5＇-CATCTCTGCAGGATTCTCTGGA-3＇。4.6琼脂糖：电泳级。 4.7Marker2000。 4.8崎肠杆菌ATCC25944。 4.950×TAE缓冲液：见附录A的A.3。4.106×上样缓冲液：见附录A的A.4。4.11 叠氮溴化乙锭（EMA，0.2mg/mL）：见附录A的A.5。4.12 溴化乙锭（10mg/mL）。 4.13 火菌离心管：1.5mL，15mL。 仪器设备 5 1