DB21/T3787—2023 非洲猪瘟病毒LAMP目视检测方法 Loop-mediated Isothermal Amplification (LAMP) Visual Detection Method for African Swine Fever (ASFV)

前言
本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由辽宁省农业农村厅提出并归口。本文件起草单位：辽宁省农业发展服务中心、中联瑞（北京）生物科技有限责任公司。本文件主要起草人：兰德松、于本良、顾贵波、曹际娟、周维、赵培、葛忠源、张雅为、孙世宇、杨作丰、刘贺、杨国丽、张春姝。本文件发布实施后，任何单位和个人如有问题和意见建议，均可以通过来电和来函等方式进行反馈，我们将及时答复并认真处理，根据实际情况依法进行评估及复审。归口管理部门通讯地址：辽宁省农业农村厅（沈阳市和平区太原北街2号）联系电话：024-23447862。
文件起草单位通讯地址：辽宁省农业发展服务中心（沈阳市沈北新区人和街95号），联系电话：024-88420057。

1 范围
本文件规定了非洲猪瘟病毒（African Swine Fever Virus）LAMP目视检测方法的生物安全基本要求，方法原理，设备、试剂和材料，检测步骤等技术内容。本文件适用于非洲猪瘟的诊断、监测及流行病学调查，适用于猪全血、脾脏、扁桃体、淋巴结、肾脏、骨髓、拭子等样品中非洲猪瘟病毒核酸的检测。

2 规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB 19489 实验室生物安全通用要求
NY/T 541-2016 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范

3 术语和定义
本文件没有需要界定的术语和定义。

4 缩略语
下列缩略语适用于本文件。
ASFV：非洲猪瘟病毒（African Swine Fever Virus）
Bst：嗜热栖热菌（Thermus thermophilus）
DEPC：二乙基焦磷酸酯（Diethyl pyrocarbonate）
EDTA-2Na：乙二胺四乙酸二钠（Ethylenediamine tetraacetic acid disodium）
LAMP：环介导等温扩增技术（Loop-mediated Isothermal Amplification）
RM：反应液（Reaction Mixture）

5 生物安全基本要求
进行ASFV检测活动时，应按照GB 19489规定执行。

6 方法原理
针对靶基因的6个区域设计4种特异引物，并引入环引物加快反应，在链置换DNA聚合酶的作用下，基因模板、引物、链置换型DNA合成酶等在60℃～65℃进行恒温扩增，15min～60min左右即可实现大量核酸扩增。在DNA合成时，从脱氧核糖核苷三磷酸底物（dNTPs）中析出的焦磷酸离子与反应溶液中的镁离子反应，产生大量焦磷酸镁沉殿，经钙黄绿素染色，呈现绿色肉眼可见的沉淀物。