猪流行性乙型脑炎诊断技术（DB32/T2608-2013） 前言 为规范猪乙型脑炎诊断技术，特制定本标准。按照GB/T1.1-2009《标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写》进行编制，本标准由江苏省农业科学院提出，起草单位为江苏省农业科学院。主要起草人包括张雪寒、何孔旺、王小敏、郭容利、倪艳秀、李彬、温立斌、周俊明、俞正玉。 1 范围 本标准规定了猪乙型脑炎的诊断技术，包括分离鉴定、间接免疫荧光技术和RT-LAMP法。RT-LAMP法适用于大批量样品的普查，适用于本病的确诊。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修订单）适用于本文件： - GB16548 病害动物和病害动物产品生物安全处理规程 - GB/T6682-2008 分析实验室用水规格和试验方法 - GB/T18638 流行性乙型脑炎诊断技术 - NY/T541 动物疫病实验室检验采样方法 3 流行病学诊断 3.1 易感动物 多种动物可感染乙型脑炎病毒，通常表现为隐性感染，但可成为传染源。猪是乙型脑炎的重要传染源，不同年龄段的猪均能够感染，但临床症状有所不同。成年猪感染后可造成严重的生殖障碍。 3.2 易感季节 本病的发生有明显的季节性，每年7-9月份发病率最高。 3.3 传播媒介 蚊虫叮咬是乙型脑炎病毒传播的主要媒介。消灭传播媒介蚊虫是本病的主要预防措施。 4 临床诊断 猪流行性乙型脑炎是一种发病率高、死亡率低的繁殖障碍性传染病，临床症状包括高热、沉郁或狂暴、意识障碍、抽搐、呼吸衰竭和脑膜刺激症。感染乙型脑炎病毒的猪症状主要表现为繁殖障碍：母猪表现为流产、死胎、木乃伊胎；公猪多表现为单侧睾丸炎，精液品质不良，失去配种能力。 5 病理学诊断 公猪睾丸不同程度肿大，切面可见睾丸实质充血、出血，并有许多颗粒状的突起，有明显的黄色坏死灶。慢性病例中，睾丸内萎缩硬化，缩到如鸡蛋大，并与阴囊粘连。流产母猪子宫内膜充血，粘膜上覆有粘稠的分泌物，膜面有少数小点状出血。子宫粘膜下组织水肿，胎盘呈炎性浸润。 6 病原学诊断 6.1 病毒分离 6.1.1 材料准备 所用试剂为分析纯，水为符合GB/T6682-2008的灭菌二级水。使用PBS、DMEM、兔抗猪乙型脑炎病毒高免血清和健康兔血清。 6.1.2 病料采集 按NY/T541规定的方法采样。对于疑似乙型脑炎病例，流产胎儿、死胎、木乃伊胎等的脑组织，以及公猪精液和猪舍蚊子等样品进行采集。将猪脑组织或蚊子（50-100只/次）分别置于研磨器中，加入PBS反复研磨，直至样品研磨成匀浆。 6.1.3 细胞培养 取培养至单层的BHK-21细胞，用PBS洗涤3次后，加入过滤的病料上清液，37℃培养箱中吸附1.5小时。 6.1.4 乳鼠接种 每只乳鼠脑内接种30μL过滤的病料上清液，每天观察小鼠精神状态，若无症状，则于接毒3周后无菌取鼠脑，加入PBS研磨成乳液后进行接种传代。 6.2 病毒鉴定 6.2.1 免疫荧光鉴定 在24孔细胞培养板中接毒，培养48-72小时后，使用预冷的丙酮固定细胞，随后进行免疫荧光实验，确认病毒感染。