ICS 11.220
B41
DB21 辽宁省地方标准
DB21/T3256—2020
非洲猪瘟病毒等温扩增快速检测方法
Loop-mediated Isothermal Amplification (LAMP) for Rapid Detection of African Swine Fever Virus

2020-04-30发布
辽宁省市场监督管理局
2020-05-30实施

前言
本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由辽宁省农业农村厅提出并归口管理。本标准起草单位：辽宁省农业发展服务中心、中国科学院微生物研究所、洛阳莱普生信息科技有限公司、辽宁佰瑞生物科技有限公司。本标准主要起草人：杨作丰、周晨阳、李秀梅、王宏燕、杨利敏、董娜、刘文军、张皓淳、姚伟、刘洋、刘近、吴洪涛、任雪建、赵培、李蓉、章春燕、吕园园、陈腾。本标准发布实施后，如有问题和建议，可通过电话和来函方式反馈。归口管理部门通讯地址：辽宁省农业农村厅（沈阳市和平区太原北街2号），电话024-23447862；标准起草单位通讯地址：辽宁省动物及产品检疫中心（沈阳市沈河区万柳塘路105号甲），电话024-24229579。

1 范围
本标准规定了非洲猪瘟病毒等温扩增快速检测方法的技术要求。本标准适用于非洲猪瘟疫病的诊断、监测及流行病学调查，适用于猪血液、脾脏、淋巴结、肾脏等组织样品中非洲猪瘟病毒核酸的快速检测。

2 规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用；凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有修改单）适用。GB19489《实验室生物安全通用要求》。

3 原理
非洲猪瘟病毒是一种DNA病毒，本检测方法利用6条特异性引物和具有链置换能力的DNA聚合酶，在等温条件下1h内完成扩增，用于非洲猪瘟病毒核酸检测。

4 仪器和器材
4.1 高速台式冷冻离心机（0~20000 r/min）
4.2 冰箱（4℃±1℃、-20℃±1℃、-70℃±1℃）
4.3 恒温LAMP扩增仪（型号：Gene-8C）
4.4 离心管（15ml、1.5ml、0.2ml PCR专用管）
4.5 微量移液器（1000μl、200μl、100μl、50μl、20μl、10μl、2μl）

5 试剂和引物
5.1 样品处理剂
5.2 ASFV-R-Mix
5.3 Bst enzyme
5.4 D-I矿物油
5.5 阳性对照
5.6 阴性对照
注：所有试剂均应为不含DNA或DNase污染的分析纯或生化试剂，使用无菌容器分装。

6 操作步骤
6.1 样品的采集、前处理、存放与运输
6.1.1 采样注意事项：采样及前处理过程中应佩戴一次性手套，防止样本交叉污染。
6.1.2 采样工具：15ml与1.5ml离心管经121℃高压灭菌20min；剪刀、镊子经160℃干热灭菌2h，无菌采血管使用真空管。
6.1.3 组织样品处理：采集肺、肝、肾、脾等组织约10g，匀浆后加入0.3ml~0.5ml悬液，60℃灭活30min，离心后取上清备用。
6.1.4 血液样本处理：采集3~5ml抗凝血，60℃灭活30min；血清样本析出后同样灭活处理备用。
6.1.5 存放与运输：样品2~8℃保存不超过24h，长期保存需-70℃冷冻，避免反复冻融（不超过3次），运输需冷链并在8h内送达实验室。

6.2 样品DNA提取
取10μl处理样本加入离心管，加入10μl样品处理剂，94℃裂解2min后离心，上清作为扩增模板。

6.3 核酸扩增
6.3.1 配置22μl ASFV-R-Mix与1μl Bst enzyme于PCR管中，加入2μl模板，混匀后进行扩增反应（后续步骤原文缺失）。