DB21/T3273—2020
猪伪狂犬病毒野毒株与gE基因缺失疫苗株TaqMan实时荧光定量PCR鉴别方法
TaqMan Real-time PCR Method for Differentiation of Wild-type Strain from gE-deleted Vaccine Strain of Pseudorabies Virus

前言
本标准根据GB/T 1.1-2009的有关规定进行制定。本标准由辽宁省农业农村厅提出并归口管理。本标准负责起草单位：辽宁省农业发展服务中心。
本标准起草人：兰德松、顾贵波、周维、杨洺扬、李可心、孙世宇、张健、刘贺、李旭、高原、丁。
本标准发布实施后，任何单位和个人如有问题和意见建议，均可以通过来电和来函等方式进行反馈，我们将及时答复并认真处理，根据实际情况依法进行评估及复审。
归口管理部门通讯地址：辽宁省农业农村厅（沈阳市和平区太原北街2号），联系电话：024-23447862。
标准起草单位通讯地址：辽宁省农业发展服务中心（沈阳市皇姑区宁山东路29号），联系电话：024-88420057。

1 范围
本标准规定了猪伪狂犬病毒（pseudorabies virus, PRV）野毒株及gE基因缺失毒株的TaqMan荧光PCR检测方法。
本标准适用于猪血液、组织脏器、精液、鼻腔拭子和细胞培养物等材料中PRV核酸的检测以及PRV野毒株与gE基因缺失疫苗株病毒核酸的鉴别检测。本标准的实验操作应在生物安全II级实验室（BSL-2实验室）中进行。

2 规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范

3 缩略语
下列缩略语适用于本标准。
gD：糖蛋白D（glycoprotein D）
gE：糖蛋白E（glycoprotein E）
PRV：伪狂犬病病毒（pseudorabies virus）

4 仪器和耗材
4.1 仪器
高速度可达12000 r/min以上的离心机、组织研磨仪、荧光PCR仪、高速冷冻离心机（可控温至4℃）、研钵、自动化核酸提取仪（如选用商品化核酸提取试剂盒）、量程离心机、2℃～8℃普通冰箱、-20℃以下普通冰箱、-70℃以下超低温冰箱、移液器（量程0.1～2μL、2μL～20μL、20μL～200μL）。
4.2 耗材
无菌无DNA酶的1.5mL离心管、0.2mL PCR反应管或八联管或96孔反应板、与移液器匹配的吸头。

5 试剂和材料
5.1 DNAzol Reagent：商品化DNA提取试剂，2℃～8℃普通冰箱中保存；或商品化核酸提取试剂盒（如磁珠法核酸提取试剂），通常18℃～25℃保存。
5.2 无水乙醇：-20℃普通冰箱中预冷。
5.3 75%乙醇：用无水乙醇和双蒸水配制，-20℃普通冰箱中预冷。
5.4 PBS：磷酸盐缓冲液（0.02 mol/L, pH 7.2），配制见附录A。
5.5 8 mmol/L NaOH溶液，配制见附录A。
5.6 2X TaqMan Fast qPCR Master Mix：为商品化探针法实时荧光PCR反应专用试剂，包含反应所需的缓冲液、酶、dNTP、Mg2+等的预混液，-20℃普通冰箱中保存，避免反复冻融。
5.7 引物和TaqMan探针，序列见附录B。
5.8 阳性对照和阴性对照：阳性对照使用PRV野毒株细胞培养物、Bartha-K61疫苗毒；阴性对照采用灭菌双蒸水或健康猪的组织材料。
5.9 除非另有说明，在检测中所用的试剂均为分析纯，实验室用水应符合GB/T 6682的要求。

6 样品采集、处理和运输
6.1 采样前准备
6.1.1 采样人员：参照NY/T 541中第5.1条的要求。
6.1.2 采样工具和器材：参照NY/T 541中第6.10.3条的要求。
6.2 样品采集
6.2.1 血液：参照NY/T...