本标准规定了军团病的诊断标准及处理原则。本标准适用于各级、各类型医疗保舰卫生防疫机构和人员对军团病病例的诊断和处理。 WS 195-2001 军团病诊断标准及处理原则 WS195-2001 标准下载解压密码：www.bzxz.net

WS195--2001
军团病（legionnairesdisease）是由军团菌属（legionella），主要是嗜肺军团菌（legionellapneumophila）引起的一种细菌性呼吸道传染病。本病在全球普遍存在。我国已有小规模爆发及散发病例。由于军团菌肺炎与其他肺炎不易区别，是老年人容易受到侵犯，一且惠病，病情相当严重。如治疗不，其病死率可高达15%一20%。为了对军团病患者提供可靠的诊断，进行合适的治疗，结合我国军团病防治工作现状.特制定本标准。
本标准附录A中A2、A3.A4、附录B中 I33、B4、B5、B6及附录C的诊断方法为参考诊断方法。本标准由卫生部疾病控制司提出。本标准负贵起草单位：中国预防医学科学院流行病学微生物学研究所：参加起草单位：协和医院。本标推主要起草人万超群、朱元、陆慰麓。本标准出卫生部委托传染病防治监督管理办公室负贵解干。338
中华人民共和国卫生行业标准
军团病诊断标准及处理原则
Diagnostic criteria and principles ofmanagement of legionnaires diseaseWS 195---2001
参照《中华人民共和国传染病防治法》及《中华人民共和国传染病防治法实施办法》制定本标准1范围
本标准规定了军团病的诊断标准及处理原则。本标准适用于各级、各类型医疗保健、卫生防疫机构和人员对军团病病例的诊断和处理。2诊断原则
2.1应根据流行病学资料及临床表现和常规实验室检验结果进行综合分析。2.2确诊需依据病人双份血清军团菌抗体恢复期较急性期增高4倍或以上或军团菌培养阳性。3 诊断标准
3.1流行病学史
全年均可发病，多数发生在夏秋季节。中老年病例较为多见。有慢性肺病病史者、免疫功能低下者、器官移植者、建筑工地施工人员、近两周内的旅行者以及吸烟者较易感。如发现两例或以上的成组病例、应当进行血清流行病学调查。同时对可疑军团病患者的标本，如痰、血液、胸水、支气管肺泡灌洗液进行军团菌的分离培养，还可从外环境如宾馆、医院、电影院等的空调系统冷却塔水、淋浴水、湖水、井水、池水以及地表面污水中分离军团菌。3.2临床表现
临床上可以有两种类型：非肺炎型（pontiac fever)和肺炎型。3.2.1 非肺炎型
临床表现类似感冒，症状：发热、咳嗽、头痛、肌痛和胸痛，但无肺炎。病程3一~10天，可自愈。3.2.2肺炎型
亚急性起病，症状：发热、头痛、寒颤、咳嗽或痰中带血，胸痛和肌痛，部分病人有恶心、呕吐、腹泻、相对缓脉，有些患者尤其是儿童，可出现精神神经症状如妄、幻觉甚至昏迷等，重症病人可发生急性肾功能衰竭、休克，或因菌血症产生的肺外器官感染。X线胸片显示肺有浸润性阴影，部分有胸腔积液，重症病人有肺脓肿甚至空洞。
3.3常规实验室检查
多数血沉加快，血白细胞计数增高，部分有中性白细胞核左移，可能有乳酸脱氢酶、血清谷草转氨酶、胆红素升高或有蛋白尿、低钠血症和低磷血症，面尿并不多见，但镜检时尿中可有红细胞。炭或气管内抽吸物作革兰染色和一般培养。军团菌为革兰阴性杆菌，但初代分离菌革兰染色着色不明显，而且培养的阳性率很低。
3.4特异性实验室检查（参见附录A、附录B、附录C）3.4.1军团菌培养
中华人民共和国卫生部2001~07-20批准2002-01-01实施
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以痰、支气管抽吸物、支气管肺泡灌洗液或胸水为标本，在含N-2-乙酰氨基-2-氨基乙烷磺酸（ACES)的酵母浸膏培养基（BCYE)中培养军团菌。3.4.2细菌抗原检测
采用直接荧光抗体法（DFA）。
3.4.3血清特异性抗体检测
采用间接荧光抗体法（IFA）、试管凝集试验（TA）等方法检测军团菌特异性抗体。起病时及3~～8周后两次血清军团菌抗体滴度呈4倍或以上增长，单次抗体大于1：256(IFA），或凝集抗体从1：40星4倍或以上增长或-一次凝集滴度为：320(TA)者，可确定有军团菌感染。3.5病例分类
3.5.1临床诊断
满足3.1、3.2、3.3加3.4.2。下载标准就来标准下载网
3.5.2确诊病例
满足3.1、3.2、3.3加3.4.1或3.4.2。4处理原则（参见附录D）
4.1早期发现病人.早期治疗：对可疑病人应及时进行特异性实验室检查以明确诊断。确诊者可选用红霉素、阿奇素等或和利福平并使用，复方新诺明、四环素、环丙沙星、强力霉素对部分病人有效。应尽量避免使用糖类皮质激素。
4.2早期发现并发症如急性肾功能衰竭、体克等应及时积极抢救。4.3如发现成组病例，应向防疫部门报告。通过流行病学调查证实后，采取合适的防治措施，对被军团菌污染的水源，如建筑物中的空调系统冷却塔水、冷热水管道系统水进行细菌学检测，必要时进行消毒处理。对可疑者及易感人群选用红霉素、阿奇素等治疗。3.40
A1直接荧光抗体染色检查法
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附录A
（标准的附录）
军团病病原学诊断方法
本法操作简便，能快速发现各种被检病理标本中是否存在军团菌。但当标本中军团菌数量较少或病原菌为荧光抗血清未包括的新种(型)时、结果常为阴性，故阴性结果不能排除军团病。A1.1荧光抗体制备
A1.1.1用1%甲醛盐水自固体培养基上洗下军团菌菌苔，4C过夜杀菌，pH7.2操作PBS洗2次，配制成4×10°/mL菌细胞的菌液。A1.1.2免疫前自家免取血，用作对照血清，采取皮内注射法或静脉注射法免疫家兔。如凝集反应效价达到1：5120以上可以全放血，并分离血清。A1.1.3免疫前兔血清与抗军团菌血清用50%，33%饱和度硫酸铵提取Y-球蛋白，调整蛋白浓度为20mg/ml。按常法用异硫氰酸荧光素（FITC)标记。A1.2标本制备
A1.2.1肺组织：新鲜组织可制成印片或研磨成10%悬液后涂膜，于空气中干燥后加热固定，再在涂膜上滴加10%中性甲醛固定10min。吸弃甲醛后用蒸馏水轻轻漂洗，干燥后镜检。如为甲醛固定组织，可用刀片切成组织块，造成新的组织面，用刀片呈直角在组织上刮取细微的组织颗粒糊，于载玻片上.涂膜，于燥后加热固定。
A1.2.2其他标本：痰、支气管灌洗液或抽出物、胸水（应注意抗凝）可选取粘性部分（胸水等也可离心取沉淀物)涂膜，干燥后加热固定。10%中性甲醛固定10min，蒸馏水漂洗，干燥后染色镜检。可疑培养物：用接种环挑取可疑菌落，混悬于1%甲醛等渗盐水中，涂膜，干燥，加热固定。A1.3染色方法
A1.3.1荧光抗体工作溶液配制：将标准军团菌株用PBS制成悬液后涂片，使每高倍视野菌数500~600条，用不同稀释度的荧光抗体染色。凡出现3+～4+荧光强度的最高稀释度为1个效价单位（3十：菌细胞发明亮的黄绿色荧光；4十：菌细胞发耀眼的黄绿色荧光）。常规工作中用2个效价单位作为.工作溶液。
A1.3.2操作：每份标本在同一张载片上作两个涂膜。一个用免疫前兔Y-球蛋白荧光素标记物染色，作阴性对照；另一用荧光抗体染色。置37C湿盒中温育30min后用PBS洗去多余的荧光血清（洗时载片加有荧光抗体的一侧向下），并用PBS浸洗2次（每次5min），蒸馏水冲洗1次，干燥，涂膜滴加pH9.Q缓冲甘油，盖玻片封固，荧光显微镜检查。A1.4结果的解释：痰胸水、气管抽吸物或灌洗液等标本，每张涂膜上只要发现5条以上染色鲜明、形态典型的军团菌，即可报告阳性。其他临床标本，每张涂片发现有≥25条强烈发荧光的细菌，报告为阳性，1～24条为可疑，0条为阴性。A2军团菌多重聚合酶链反应（MPCR）和产物检测（参考）A2.1寡核苷酸引物的合成
由中国预防医学科学院流行病学微生物学研究所军团病课题组设计的一对引物，用以扩增嗜肺军团菌，可产生206bp的产物（mip基因片段）。另一对引物为扩增16SrRNA用。不仅可检测嗜肺军团菌种.而且可以检测某些非嗜肺军团菌种。3.41
A2.2扩增程序
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在容积为0.5ml.的Eppendorf离心管中加人（100μl）：10XPCR缓冲液
Taq酶
引物(1、2)(mip）
引物（3、4)（16SrRNA）
1/10体积
200 μmol/L
2units
0. 2 μmol/1.
0. 05 μmol/1
模板DNA（可用至2μg，取决于靶序列含量）加灭菌三蒸水至最终体积100μL，最后加入40μL的灭菌石蜡油。试验分别设立阳性对照和阴性对照各·份。
A2.3循环参数
首次循环
正式循环
末次循环
循环次数
取扩增产物10μl.加人2μl6×溴酚蓝电泳指示缓冲液，在含有0.5μg/mL的溴化乙锭的琼脂糖凝胶，于0.5×TBE（或TAE)缓冲液中进行电泳，电压5V/cm，电泳30min后，在紫外灯下观察结果，A2.4结果
凝胶中出现两条特异性DNA带【分别为206个碱基对（206bp)及386个碱基对（386bp）)或一条特异性DNA带（386bp）则PCR为阳性，如重复试验后未出现特异性DNA带，则PCR结果为阴性。如待检材料（痰、支气管灌洗液、血液等）PCR阳性，则提示标本中有特异性军团菌DNA片段，出现两条特异性DNA带为嗜肺军团菌感染，一条特异性DNA带为非嗜肺军团菌感染。A3协同凝集试验（参考）
此法原理是利用金黄色葡萄球菌A蛋白（SPA)可与某些动物IgG的Fc段结合的特性，将军闭菌的特异性抗体（IgG组分）结合于含SPA的金黄色葡萄球菌上，再用此致敏SPA菌液与标本（含军团菌可溶性抗原的检样或可疑军团菌培养物）进行协同凝集试验。此法重复性及稳定性较差，但操作方便，可供参考。
A3.1试剂
A3.1.1SPA菌稳定液
A3.1.1.1将含SPA的金黄色葡药球菌Cowan1株或Nol800株接种于固体培养基或液体培养基。固体培养基：蛋白陈（或脉陈）10g，葡萄糖1g，氯化钠3g，磷酸氢二钠（Na.HPO·12H20)2g，琼脂25g，牛肉汤1000ml.用氢氧化钠溶液调pH至7.4，121C20min高压灭菌，倾注平皿。液体培养基：（T，培养基）：胰蛋白陈（trypticase）5g，半胱氨酸100mg，酵母浸膏37.5mL，葡萄糖5g，氯化钠3.75g，蒸馏水500ml.，调pH至7.4，115C30min灭菌。葡萄球菌Cowan1株以接种液体培养基为好，在固体培养基上生长者易发生菌体自凝。
A3.1.1.237C培养24h后，用0.01mol/LpH7.4PBS自固体培养基上洗下菌苔，3000r/min离心20min（如在液体培养基中培养，则直接离心）。弃取上清，沉淀用PBS洗2次，再用含0.5%甲醛的PBS配成10%（V/V）悬液，于室温放置3h或过夜。然后置80C水浴15min（时时摇动），取出后迅速冷却，用PBS洗3次，再用含10g/1.NaN：的PBS配成10%(V/V）悬液。4C保存可用半年。用前离心，弃上清，用PBS洗1次。
A3.1.2致敏SPA菌液（抗体-葡萄球菌复合物）：取上述10%SPA菌稳定液1mI.，加军团菌种或型特异性抗血清0.1ml.，混勾于室温反应30min，时时摇动。反应完毕，用PBS洗2次，沉淀感于含342
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1.0g/LNaN，的PBS10mL中，制成1%悬液（或2%）。分装，4C保存，可用半年左右。A3.2试验方法与结果判定
试验在载玻片上进行。取致SPA菌液1滴，加标本（如为尿标本可沸水浴5min，离心去沉淀。必要时可用分子量6000的聚乙二醇浓缩10～50倍。如为待鉴定的细菌培养物，可制成10亿菌/mL，然100C水浴15min），1滴（尿）或内径5mm接种环一满环（菌液）。充分摇勾，在8W日光灯上方观察结果。判断标准为：
4十：菌体凝成大块，液体透明。3十：菌体凝成大颗粒，液体透明。2十：菌体凝成较大颗粒，液体较透明。1十：菌体凝成小颗粒，液体混浊。：无颗粒形成.液体全混。或2min后才有细小颗粒。一般以≥2十为阳性。
将菌液100C加热15min，可以避免嗜肺军团菌，博杰曼军团菌和米克戴德军团菌等鞭毛1的非特异性类属抗原所引起的交叉协同凝集反应。A4乳胶凝集试验（参考）
将市售聚苯乙烯胶乳（polystyrenelatex）颗粒（0.8um）用蒸馏水配制成贮存液，使其在1：100稀释时于650nm吸光度达0.355。取1份胶乳贮存液加抗军团菌抗体IgG(100g/ml.)和用0.1mol/l.pH8.0比氨酸缓冲液配制的牛血清白蛋白（200μg/ml.）混合液1份，充分摇勾数分钟，37C水浴2h.再加人1%牛血清白蛋白2份，37C水浴30min。于4C18000g离心10min。沉淀用1%牛血清白蛋白洗1次，再悬人1份牛血清白蛋白中，加叠氮钠（NaN，）至0.04%，4C保存。对照胶乳试剂用来免疫家兔IgG同法制备。待检尿标本沸水浴5min，以减少非特异凝集，离心除去沉淀，涂于黑玻璃上的圆环内，滴致敏乳胶和尿标本各1滴.充分混勾，在防止于燥的情况下于180次/min展荡器上摇动20min。肉眼观察，以≥十为阳性。用此法检测尿中嗜肺军团菌血清1型可溶性抗原。A5细菌分离培养
A5.1军闭菌培养基的制备（1000mL）A5.1.1称10gN-二乙酰胺基-二胺基乙烷磺酸（ACES)倒入锥形瓶，加蒸馏水950mL;A5.7.215ml.10mol/.氢氧化钾溶液调pH至7.0;A5.1.3称10g酵母浸膏加人锥形瓶，混合后分装到两个锥形瓶中，各500ml；A5.1.4每个锥形瓶再加人10g琼脂粉和1g活性炭，121.3C20min（同时高压-小瓶蒸馏水和两个滤器，两支注射器)；
A5.1.5分别称0.4g焦磷酸铁和0.6gL-半胱氨酸盐酸盐，置于两个平Ⅲ中；A5.1.6待培养基温度降至约60C时，将灭菌蒸馏水溶解的焦磷酸铁和半胱氨酸、通过滤膜(0.22μm）过滤除菌，等量加到两个锥形瓶中；A5.1.7倒人平m，每个约20ml.，覆盖整个平血底部。A5.2痰液直接培养法
A5.2.1试剂配制
A5.2.1.1酸中和试剂的配制
A：0.2mol/l.氯化钾溶液（14.9g/1.)B:0.2 mol/L 盐酸(17.2 ml/L)
18份A和1份B混合pH2.0
A5.2.1.2碱中和试剂的配制
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C：0.1mol/L氰氧化钾溶液（6.46g/1.）取C10.7ml.+89.3mL蒸馏水pH13
A5.2.2步骤
A5.2.2.1取少量病人痰液至试管中，加1mL酸中和剂，混勾，静置10min；A5.2.2.2加人1ml碱中和剂，混勾，静置10min。离心沉淀，吸取少量沉淀物到BCYE培养基（平皿）上划线接种。35C烛缸中孵育。观察7天，如发现可疑菌苔，进一步进行鉴定附录B
（标准的附录）
军团病的血清学诊断方法
B1接荧光抗体染色法
B1.1试验用液
B1.1.1稀释液：稀释菌液、血清及荧光抗体用0. 01 mol/L PBS
氯化钠
磷酸氢二钠
磷酸二氢钾
蒸馏水
B1.2实验步骤
B1.2.1抗原片：抗原片用酒精棉球擦后，用稀释液将菌液稀释10倍，使之成为10亿/mL，然后滴人抗原片孔中，待自然干燥后，用丙酮固定30min；B1.2.2取反应板递倍稀释待检血清，1：8~～1：512，分别滴加到抗原片中，留两孔作为对照，置湿盒中,37（孵育 1h：
B1.2.3洗涤3次，每次3min，不断摇动；B1.2.4用稀释液按1：8稀释荧光抗体.加人每孔，置湿盒中，37C1h；B1.2.5洗涤，同上。
B1.2.6结果判断：
4+：菌细胞发出耀眼的黄绿色荧光；3+：菌细胞发出明亮的黄绿色荧光；+荧光清晰，但较3+弱；
十：荧光较弱，刚可辨认；
一菌细胞不发荧光。
B2试管凝集试验
B2.1将洁净无菌处理的试管整齐摆放于试管架上，每一班清型5管，另设阴性对照（抗原对照）B2.2在第~-管中加人经高压灭菌的生理盐水0.9mL，其余各加0.5mL，阳性对照管加人0.5mL适当稀释的兔抗军团菌清；
B2.3在第--管中加人0.1ml.待检血清，倍比稀释。B2.4将浓缩的凝集抗原（制备方法同B1）用经高压灭菌的生理盐水稀释到终浓度为10亿/ml.，各管分别加入稀释后凝集抗原0.5ml，其最终凝集反应滴度为1：20～1：320，35～37C反应过夜.次口观察结果。
B2.5结果判定：
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4十：上消完全透明，菌体于管底呈伞状沉淀，摇荡时沉淀物产生絮片及颗粒（100%凝集）3+：上清儿乎完全透明，有同样的沉淀，当摇荡时产生絮片及颗粒（75%凝集）；2十：上清稍为透明，有同样的沉淀，当摇荡时产生絮片及颗粒（50%凝集）；1十：液体有勉强的透明度，底部有不大的扇状沉淀；：液体均匀混浊，底部无扇状沉淀。B2.6标准：凝集度为“十十”的血清最大稀释度为血清效价。B2.7单份血清抗体效价1次大于等于1：320或双份血清抗体效价从1：40呈4倍或以上增长者可诊断为该逍清型军团菌抗体阳性。B3微量凝集试验（参考）
B3.1实验用液：稀释液
0. 067 mol/L, PBS
磷酸氢二钠（NazHPO，·12H,O)磷酸二氢钠(NaH,PO4·2H,O)
氯化钠
蒸馏水
B3.2实验方法
B3.2.1V形孔板每孔加25ul.稀释液；pH6.4
1 000 ml.
B3.2.2第一孔加人25μL待检血清，倍比稀释，最后一孔留作阴性对照，（抗原对照）B3.2.3S稀释凝集抗原.5倍稀释，使菌液浓度成为20亿/ml.，每孔25ul；B3.2.4置湿盒中371h，再置4C冰箱4h；B3.2.5置日光灯下观察结果，以1：32为阳性或双份血清有4倍增高者有诊断意义。B4ISA法
B4.1缓冲液
B4.1.1包被液：碳酸盐缓冲液（pH9.6）碳酸钠（无水）
碳酸氢钠
蒸馏水
B4.1.2稀释液：磷酸盐缓冲液（pH7.4）氯化钠
磷酸氢二钠(Na2HPO，·12H,O)
磷酸二氢钾
蒸馏水
1000ml
B4.1.3洗涤液：上液加入0.5ml.吐温-20；B4.1.4底物缓冲液：(pH5.0）
甲液：C,HO,（无水）
乙液:Na2HPO,·12H0
19. 2 g/l
甲液24.3mL，乙液25.7ml，蒸馏水50ml，混合即得pH5.0磷酸枸橼酸缓冲液100ml.B4.1.5邻苯二胺底物配制：
磷酸枸橡酸缓冲液（pH5.0)
邻苯二胺
100 ml
30%过氧化氢溶液
B4.2操作方法
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B4.2.1包被：用包被液1：100倍稀释可溶性抗原（按常规方法制备），酶标板各孔加人稀释过的包被液100μl，4C冰箱过夜；
B4.2.2洗涤：3次，每次3min；
B4.2.3封闭：用含1%小牛血清自蛋白稀释或1%白明胶稀释液，37C，30min；B4.2.4洗涤同上，加待检面清100uL/孔，血清从1：10倍比稀释至1：2560，最后一孔为阴性对照，每批实验中，每型设一排阳性血清对照和正常兔血清对照。B4-2.5洗涤，加酶结合物100μl/孔，37C.1h。B4.2.6洗涤，加邻苯二胺底物液100μl/孔，37C，15min，每孔加人50μl，2mol/L硫酸溶液终止反应。
B4.2.7结果判定：^=495nm测D）值质控标准：阴性对照
阳性血清在≥1：320稀释度
正常兔血清在<1：320稀释度A<0.3待检血清A≥0.3为该份血清军团菌抗体最终滴度，单份血清滴度≥1：320或双份血清抗体滴度有 4倍增高者，有诊断意义。
B5Dot-ELISA方法检测军团菌抗体（参考）B5.1溶液的配制
B5. 1.1 PBS-旺温(pH7.4)
磷酸二氢钠(NaH,PO.·12H,O)
磷酸氢二钾
氯化钠
蒸馏水
叶温20
10 mmol/L TBS
氯化钠
浓盐酸
蒸馏水
1 000 ml
1 000 mL
B5.1.3封闭液：用100mmol/LTBS稀释脱脂牛奶，使浓度为50g/L。B5.2步骤
按需要取适当大小的硝酸纤维素膜，用尺子划上小方格；点膜：将标准可溶性抗原，相当于20亿/mL(浊度)点于小格内，每格2μl，自然风干；B5.2.2
封闭：用封闭液封闭30min；
倒掉封闭液，加待测血清，血清也用封闭液稀释，置摇床上，室温振荡2h；B5.2.5
吸出血清稀释液，用PBS-吐温洗3次，每次1min；加酶标羊抗人IgG结合物反应，室温摇床振荡2h，酶也用封闭液稀释；B5.2.6
洗涤：用PBS-吐温洗2次，100mmol/LTBS洗1次。B5.2.7
显色液：
4-氯-1-苯胺
冷乙醇（--·20（保存）
100mmol/LTBS
30%过氧化氢溶液
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12 μl
B5.3结果：显色20min，显色时也在室温下振荡20min，有颜色且为实心者，滴度达到1：320为阳性，每次实验时均设阳性和阴性对照。B6间接血凝试验（参考）
B6.1军团菌可溶性抗原制备
军团菌抗原结构复杂，用溶菌酶和DNA酶消化，乙酸锂和EDTA提取及DEAE纤维素柱写Sepharose6B柱层析等方法，自嗜肺军团菌血清1型（Knoxville1株）和血清2型（Togus1株）分离出型特异和型共同性的两种抗原。型特异性抗原是一种脂蛋白-碳水化合物的复合物，电泳时有4条区带。如用pH7.0PBS自琼脂培养基上洗下嗜肺军团菌血清1型（(Philadelphial株）的菌苔，15000g离心20min，上清用滤膜过滤，冻干，与免抗血清或人恢复期血清作琼脂双相扩散试验，至少可出现3条沉淀线。经Sepharose6B柱分离，可形成两个主峰。其中第峰含35%的碳水化合物，2.6%蛋白，1.8%磷脂和1%2-酮-3-脱氧辛酸盐是间接荧光抗体试验和微量凝集试验的靶抗原，有型特异性，分子量>4×10°道尔顿。用免疫酶标记技术证实存在于菌细胞表面。间接血凝试验所用的可溶性抗原，系用PBS浸取的粗制抗原。制备方法如下：B6.1.1用灭菌的0.01mol/1pH7.2PBS自BCYE琼脂培养基上洗下菌苔，于Arnold灭菌器内101C处理1h（或沸水浴1h），离心弃上清；B6.1.2用灭菌PBS洗沉积的菌细胞2次：B6.1.3按每0.1mL.沉淀菌细胞加灭菌PBS2mL，制成细菌悬液。于4C置10天，经常摇动；B6.1.43500r/min离心20min，上清即为可溶性抗原。B6.2致敏绵羊红细胞
取20%甲醛、丙酮醛醛化红细胞悬液0.1mL（绵羊红细胞双醛化法，见“注”），1500r/min离心5min，弃上清，加人用0.2mol/l.pH4.0乙酸-乙酸钠缓冲液稀释的军团菌可溶性抗原1ml（稀释度通过方阵滴定法预试选定），混勾。37C水浴1h致敏。用PBS洗3次后，以含1g/L明胶，0.4g/L.牛血清白蛋白、0.5%(V/V)羊细胞膜的pH7.2.0.11mol/LPB(稀释液）配成0.7%悬液。B6.3操作与结果解释
于V型46孔微量血凝反应板上按常法进行，待检血清用稀释液自1：2起作连续双倍稀释至1：4096。试管排各孔补加稀释液1滴，阻断试验排各孔加最适稀释度抗原1滴，然后各孔均加致敏红细胞1滴。各孔总量为0.075ml，混匀】min，置37C湿盒1～2h后观察结果。以50%（2+）凝集为终点。阻断试验排出现血凝抑制应≥2孔。每批试验应以相应的免抗军团菌抗血清作阳性对照，其血凝效价变化不应2孔。如双份血清抗体效价明显增高者，可考虑军团菌感染。注：双醛化绵羊红细胞(SRIBC)的制备1.将SRBC用10～20倍容积0.11mol/LpH7.2PB洗5次，再用此PB配成8%悬液；2.缓慢加人等容积丙酮醛、甲醛混合液（丙酮醛15ml,甲醛8mL,0.11mol/l.pH7.2PB60ml,用100g/l氧氧化钠溶液调pH至7.2，再补加PB至100mL），室温缓慢搅拌17h，1500r/min离心20min，弃上清.沉积细胞用PB洗3次，并配成20%悬液，加叠氮钠(NaN)至1g/L，4C保存备用。附录C
（标准的附录）
军团病分子生物学诊断方法（参考）用地高辛标记的特异性军团菌DNA探针进行核酸杂交检查，全过程包括探针标记、靶DNA的制347
备、膜结合、杂交和显色5个步骤。CT地高辛（DIG）标记DNA探针
WS 1952001
C1.1特异性DNA片段的获得：PCR或全染色体酶切（取特定分子量片段）。C1.2IDNA片段的纯化和回收：低溶点琼脂糖凝胶纯化法或透析袋纯化法，经酚/三氯甲烷抽提，乙醇沉淀。
C1.3DNA片段的DIG标记：（随机引物法）将完全变性的DNA片段加进微型离心管内（置于冰浴中），分别加人2 μl.
六核苷酸混合物
NTP标记混合物
再加人适量灭菌三蒸水调溶液体糕为19u，短暂离心，最后加人1Klenow，混匀，37C孵育1h以上，也可过夜。用EDTA终止反应。C1.4探针的标记效果检测：（Dot blot反向杂交法）将已制备好的探针100C沸水浴变性5min，立即置于冰水浴中5min以上。取少量（1班L左右）点于硝酸纤维素膜上，80C固定后，直接进人结果检测过程。C2靶DNA的制备
C2.1细菌培养：军团菌BCYE培基，35C烛缸培养48h；C2.2DNA提取：SDS裂解，酚/三甲烷抽提法。C3DNA结合于硝酸纤维素膜
C3.1Southernblot：电泳结束后，琼脂糖凝胶变性60min（变性液：0.6mol/L氯化钠溶液0.2mol/l氢氧化钠溶渡），蒸馅水漂洗1min；和60min(中和液：0.15no1/LTris-HClpH7.6.1.5mol/1.鐵化钠溶液），弃中和液转膜。
C3.2Dotblot：将DNA样品在沸水浴中变性10min，迅速放于冰水中，用微量加样器将样品加到硝酸纤维膜上，晾于后80C固定2h。以三蒸水或已知无特异DNA片段的样本作为阴性对照。C4探针与靶DNA杂交
D4.1预杂交：将转移好的硝酸纤维素膜装人大小样仿的塑料袋内，加人预杂交液，封口，68C预杂交1h以上，晃动。
C4.2杂交：去预杂交液，加人杂交液（含Dig-11-dUTP标记探针，其余成分同预杂交液），70C保6h以上（杂交条件取决于探针和靶DNA）。洗去未杂交的探针：2×SSC.1.0g/LSDS100mlL，5mn×2室温：0.1XSSC，1.0/1.SDS100mL，70C，15min×2。洗膜时置摇床上摇动。C5杂交结果的检测
C5.1地高辛抗体结合：先将杂交膜在缓冲液1中室温洗1min换缓冲液（100mL）室激洗膜30min，倾去液体，加人20mL抗体液（含抗体地高辛150u/mL，缓冲液）浸泡30min，室温。C5.2显色：用缓冲液1100mL洗膜，15min×2，去除未结合的抗体；换缓冲液避20ml.平衡膜2min。将膜装人塑料袋内，加入10ml.显色液，封膜，避光数分钟至24h，及时观察，到显色满意时，用50ml缓冲液V洗膜终止反应。
C6结果判定：当硝酸纤维素膜上出现有蓝色条带(Southernblot，大小与琼脂糖凝胶中DNA条带相仿）或蓝色圆点（Dotblot），即为检测结果阳性，同，阴性对照应无染色。部分试剂的配制
20XSSC:
氯氟化钠
Na·C.H.O,2H,0
ws 195--2001
10mol/L氯氧化钠调pH值到7.0,加蒸馏水至1000ml50 X Denhart :
聚燕糖(Ficol1400)
聚乙烯吡喀烷酮（PVP）
牛血清白蛋白（BSA）
蒸馏水
溶解后，微孔滤膜过滤灭菌.10mL分装，20C贮存备用。预杂交液：
50X Denhart
20×SSC
100 g/L SDS
蒸馏水
缓冲液1：
100 mmol/1. Tris-HCI
150mmol/l，氯化钠
缓冲液1：
封闭液（10%）
缓冲液1
缓冲液置：
100 mmol/LTris-HC
100mmol/L.氯化钠溶液
50mmol/l.氟化镁溶液
缓冲液N：
10 mmo1/.. Tris-HC1
1mmol/L, EDTA
色液：（现配）
非肺炎型
D1, 1 对症治疗
D1.2病原治疗
缓冲液
附梁D
（标准的附录）
军团病治疗原测
口服红霉素1-~2.0g/日或阿奇罐素、克拉鑫素、罗红霉素、环内沙星、四环素、磺胺甲异嗯唑甲芊胺嘧啶等。
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