ICS 65.020.30 CCSB44 黑龙江省地方标准 DB23/T3873—2024 实验猪副流感病毒5型RT-PCR检测技术规范 发布单位：黑龙江省市场监督管理局 发布日期：2024-08-30 实施日期：2024-09-29 前言 本文件按照 GB/T1.1-2020 《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》起草。本文件可能涉及专利，发布机构不承担专利识别责任。由黑龙江省科学技术厅提出并归口，起草单位为中国农业科学院哈尔滨兽医研究所。主要起草人：陈建飞、冯力、刘怀然、张鑫、郭龙军、石达、时洪艳。 1 范围 本文件规定了实验猪副流感病毒5型RT-PCR检测的样品采集、样品记录保存、样品处理、病毒RNA提取、RT-PCR操作程序和结果判定的要求，描述了相应操作方法。适用于实验猪粪便、小肠及内容物中副流感病毒5型的定性检测。 2 规范性引用文件 本文件的应用依赖以下文件。注日期的引用文件，仅该日期版本适用；未注日期的引用文件，其最新版本（包括修改单）适用。 - GB/T6682 分析实验室用水规格和实验方法 - GB19489 实验室生物安全通用要求 - NY/T1948 兽医实验室生物安全要求通则 - SN/T4835-2017 实验室生物废弃物管理要求 3 术语和定义 本文件无需界定新的术语。 4 缩略语 cDNA：互补脱氧核糖核酸（complementary deoxyribonucleic acid） DEPC：焦碳酸二乙酯（diethyl pyrocarbonate） ddH2O：双蒸水（double distilled water） dNTPs：三磷酸脱氧核糖核苷混合物（deoxyribonucleotidetriphosphate mixture） M-MLV：莫洛尼鼠白血病病毒（Moloney Murine Leukemia Virus） PBS：磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline） PPIV5：猪副流感病毒5型（Porcine Parainfluenza Virus） RNA：核糖核酸（ribonucleic acid） RNase：核糖核酸酶（ribonuclease） RT-PCR：反转录-聚合酶链式反应（reverse transcription-polymerase chain reaction） 5 基本要求 5.1 生物安全 应按照 GB19489、NY/T1948、SN/T4835-2017 的规定执行。 5.2 人员 5.2.1 采样人员应具有专业技术知识，熟练掌握采样程序和操作技术，采样时佩戴口罩、手套，穿一次性防护服和鞋套。 5.2.2 检测人员进行样品处理、病毒RNA提取和RT-PCR操作时，应穿工作服、戴一次性无菌手套。 6 样品采集 6.1 采样工具 手术刀、剪刀和镊子应无菌处理；使用一次性无菌注射器、无菌采样棉签和无菌采样管（2 mL、25 mL、50 mL）。 6.2 粪便采集 使用一次性无菌注射器吸取腹泻猪粪便1～2 mL，或轻轻挤压腹泻猪腹部，用无菌采样棉签从肛门采集粪便5～10 g，放入无菌采样管中编号保存。 6.3 小肠及内容物采集 用手术刀剖开病死仔猪腹腔，在病变明显的肠管两端结扎，用剪刀在结扎线外剪断，放入无菌采样管中编号保存。 7 样品保存与记录 7.1 保存 样品应及时以低温运输到实验室。2～8℃保存不超过24小时；-20～-15℃保存不超过1个月。 7.2 记录 收到样品后，应建立完整记录。 8 样品处理 8.1 粪便 在生物安全柜内向保存样品的无菌采样管中加入等体积含双抗的0.02 mol/L pH7.2 PBS（A.1），使用振荡器2000 r/min震荡3～5分钟，离心机4℃、5000 r/min离心2分钟，取上清液立即提取病毒RNA。如无法立即检测，可冷冻上清液并在2日内提取RNA。 8.2 小肠及内容物 在生物安全柜内取3～5 cm的小肠及内容物，称重后加入含双抗的0.02 mol/L pH7.2 PBS（A.1）按重量体积比制成5倍悬液，经离心机4℃、5000 r/min离心20分钟，取上清液用于病毒RNA提取。