ICS65.020 CCSB40 DB35 福建省地方标准 DB35/T1992—2021 番鸭细小病毒和鹅细小病毒双重实时荧光定量PCR鉴别诊断技术 Diagnostic technique of duplex real-time fluorescent PCR for the detection of muscovy duck parvovirus and goose parvovirus 地方标准信息服务平台 发布于2021-08-17，实施于2021-11-17。发布机构：福建省市场监督管理局。

目次：
前言
1 范围
2 规范性引用文件
3 术语和定义
4 原理
5 试剂与材料
6 仪器设备及耗材
7 操作方法
8 结果判定
附录A（规范性）
附录B（规范性）
附录C（规范性）
附录D（资料性）
附录E（资料性）

前言
本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由福建省农业科学院提出，由福建省农业农村厅归口。本文件起草单位：福建省农业科学院畜牧兽医研究所。本文件主要起草人：林魁、王劭、陈少莺、陈秀琴、黄梅清、程晓霞、肖世峰、陈仕龙、林锋强。

1 范围
本文件规定了鉴别检测番鸭细小病毒（Muscovyduckparvovirus，MDPv）和鹅细小病毒（Gooseparvovirus，GPV）双重实时荧光定量聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）方法的原理、试剂与材料、仪器设备及耗材、操作方法、结果判定。本文件适用于番鸭细小病毒、鹅细小病毒的核酸检测和鉴别。

2 规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
GB 19489 实验室生物安全通用要求
NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范

3 术语和定义
3.1 Ct值（Cycle Threshold）：每个反应管内荧光信号达到设定的阀值所经历的循环数。
3.2 融解（解链）温度（Melting temperature；Tm值）：核酸加热变性过程中，紫外光值达到最大值的50%时的温度称为核酸的解链温度，由于这一现象和结晶的融解相类似，又称融解温度。注：基于产物长度和G/C含量的不同，扩增产物会在不同的温度点解链。

4 原理
MDPV与GPV全基因序列在核苷酸水平上同源性约为81.9%。基于两种水离细小病毒基因核苷酸序列上的差异，分别设计两对特异性PCR引物，分别扩增两种病毒VP基因序列上的一段CCbp左右特异性片段。在PCR反应体系中加入过量双链嵌合荧光染料，荧光染料非特异性地掺入脱氧核糖核酸（Deoxyribonucleic acid，DNA）双链后发射荧光信号；而不掺入链中的荧光染料则不会发射任何荧光信号。从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步，呈现正向对应关系。
当PCR反应结束后，通过重新加热扩增产物（反应温度逐渐升高），使结合了荧光染料分子的双链DNA解离或“融解”成单链DNA，荧光强度发生显著变化，形成一幅融解曲线图。由于上述两个特异性片段的Tm值不同，造成不同的PCR产物融解曲线特性不一样（出现峰值所对应的温度不同）。通过分析扩增后融解曲线，可以简单、直接地判断实时荧光定量PCR反应产物的目的基因片段，以此来鉴别MDPV和GPV。

5 试剂与材料
5.1 除另有规定外，所用生化试剂均为分析纯。
5.2 PBS（磷酸盐缓冲溶液）：0.01mol/L（pH7.2）PBS的配制方法按照附录A要求，4℃保存。试验用水应符合GB/T 6682的规定。
5.3 核糖核酸酶（20mg/mL）。
5.4 10% SDS（十二烷基硫酸钠溶液）。
5.5 蛋白酶K（10mg/mL）。
5.6 Tris-盐酸饱和酚（pH7.6）