ICS 11.220 B41 备案号：42002-2014 DB21 辽宁省地方标准 DB21/T 2251-2014 猪流行性腹泻病毒RT-PCR检测方法 Method of RT-PCR for the detection of porcine epidemic diarrhea virus 2014-03-07发布 2014-05-07实施 辽宁省质量技术监督局 发布 前言 本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。本标准由辽宁省动物疫病预防控制中心提出，由辽宁省畜牧兽医局归口。起草单位：辽宁省动物疫病预防控制中心、辽宁省动物医学研究院。本标准主要起草人：于学武、顾贵波、陈瑶、赵晓彤、赵凤菊、刘坤洋、关乃鹏、王冰、邓文超、习贺军。 1 范围 本标准规定了猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）RT-PCR检测方法的原理、仪器和器材、试剂和材料、操作步骤及结果判定。本标准适用于猪流行性腹泻的诊断和监测，适用于肠内容物、粪便以及细胞培养物中PEDV核酸的检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有修改单）适用于本文件。 3 缩略语 PEDV：猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus） DEPC：焦炭酸二乙酯（diethyl pyrocarbonate） RNA：核糖核酸（ribonucleic acid） bp：碱基对（base pair） RT-PCR：反转录聚合酶链式反应（reverse transcription polymerase chain reaction） Taq酶：Taq DNA聚合酶（Taq DNA polymerase） 4 原理 PEDV是一种RNA病毒。其RNA经反转录生成cDNA后可作为PCR扩增模板。根据PEDV保守基因序列设计特异性引物，在DNA聚合酶作用下，以cDNA为模板进行变性、退火和延伸循环扩增，从而获得目的DNA片段。 5 仪器和器材 本方法所需主要仪器包括：高速台式冷冻离心机（最大离心力≥12000×g）、冰箱（2~8℃、-20℃、-70℃）、PCR扩增仪、电泳仪、凝胶成像系统、微波炉、分析天平、1.5 mL离心管、0.2 mL离心管、微量移液器及吸头等。 6 试剂和材料 6.1 Trizol RNA抽提试剂，4~8℃保存 6.2 氯仿，4℃预冷 6.3 异丙醇，4℃预冷 6.4 75%乙醇（DEPC水配置），-20℃预冷 6.5 DEPC水（0.1%处理后高压灭菌） 6.6 RNA酶抑制剂（40 U/μL） 6.7 Taq DNA聚合酶（5 U/μL） 6.8 dNTP（2.5 mmol/L） 6.9 引物（20 μmol/L） 上游引物F：5'-TTCCCAGCGTAGTTGAGATTG-3' 下游引物R：5'-CGAAGTGGCTCTGGATTTG-3' 6.10 AMV反转录酶 6.11 Oligo(dT)-Adaptor引物（2.5 μmol/L） 6.12 阴性对照（水） 6.13 阳性对照（PEDV细胞） 6.14 PBS缓冲液（0.02 mol/L，pH 7.2） 6.15 TAE电泳缓冲液 6.16 溴化乙锭 6.17 DL2000 DNA Marker 7 操作步骤 7.1 样品的采集、前处理、存放和运送 7.1.1 采样注意事项 采样及样品前处理过程中应佩戴一次性手套，避免样本间交叉污染。 7.1.2 采样工具 药匙、15 mL离心管及1.5 mL离心管经121℃高压灭菌15 min；剪刀、镊子经160℃干热灭菌2 h。 7.1.3 肠内容物的采集与前处理 采集病死或剖检猪小肠内容物，加入15 mL灭菌离心管中，按1:5比例加入PBS混匀，3000 rpm离心20 min，取上清液转入1.5 mL离心管编号备用。 7.1.4 粪便的