DB23/T3168—2022
盐碱土壤嗜盐细菌与古菌资源分离与快速分类技术规程

前言
本文件依据GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由黑龙江省农业农村厅提出。本文件起草单位：黑龙江省农业科学院土壤肥料与环境资源研究所。本文件主要起草人：王爽、孙磊、金品娇、李伟群、陈雪丽、万书明、刘凯、李一丹、孙秀君。

1 范围
本文件规定了盐碱土壤嗜盐细菌与古菌资源分离与快速分类技术的术语和定义、原理、一般要求、分离方法和分类方法。
本文件适用于盐碱土壤中嗜盐细菌和嗜盐古菌的分离与快速分类。

2 规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T19495.2 转基因产品检测实验室技术要求
GB/T19495.3 转基因产品检测核酸提取纯化方法
NY/T1114-2006 微生物肥料实验用培养基技术条件
NT/T1377 土壤pH的测定
NT/T1121.16 土壤检测第16部分：土壤水溶性盐总量的测定
NY/T2066-2011 微生物肥料生产菌株的鉴别聚合酶链式反应（PCR）法
NY/T2321-2013 微生物肥料产品检验规程

3 术语和定义
3.1 嗜盐微生物（Halophiles）
在盐环境中生长旺盛的一类喜盐的微生物，包括原核生物（细菌和古菌）和真核生物。根据它们对氯化钠的需求，可分为轻度（最适盐浓度0.2mol/L~0.5mol/L）、中度（最适盐浓度0.5mol/L~2.5mol/L）和极端嗜盐菌（最适盐浓度2.5mol/L~5.2mol/L）。
3.2 嗜盐细菌（Halophilic bacteria）
分类学上属于细菌域（Bacteria domain），在0.2mol/L～2.5mol/L盐浓度范围内有最佳生长的一类嗜盐微生物，主要为轻度和中度嗜盐细菌。
3.3 嗜盐古菌（Halophilic archaeon）
分类学上属于古菌域（Archaea domain），在含2.5mol/L～5.2mol/L盐浓度范围生长最好的一类极端嗜盐微生物。
3.4 分类（classification）
选择特定的引物，采用聚合酶链式反应（PCR）法快速扩增嗜盐细菌和嗜盐古菌分离株的16S rRNA基因，在进一步测序的基础上进行16S rRNA基因序列的系统发育学分析来判定所属细菌或古菌的类别。

4 原理
16S rRNA序列的系统发育学进化距离与表型特征及化学分类数据有非常好的相关性，但传统的微生物分类学方法比较繁琐费时，而PCR快速扩增嗜盐细菌和嗜盐古菌的16S rRNA基因相对简单快捷。本方法采用细菌和古菌的特异性引物对分离菌株的16S rRNA基因进行PCR扩增，对PCR产物进行电泳检测、纯化和测序，并将测得的分离菌株的16S rRNA基因序列和来自GenBank数据库中的序列进行比较和系统发育学分析，来鉴定其为细菌还是古菌。

5 一般要求
试验操作人员应具备良好的微生物学知识积累和分子生物学专业技能，操作熟练。实验室有毒、有害、废弃物质的处理及个人安全防护应符合GB/T19495.2的要求。

6 分离方法
6.1 工具
电子天平（万分之一），2mm孔径的筛子，往复式电动振荡机，锥形瓶，无菌大试管，无菌水，微量可调移液器（100μL-1000μL），培养皿，玻璃刮铲，接种环，全自动高压灭菌锅，超净工作台，恒温培养箱。
6.2 培养基的选择与培养基平板的制备
6.2.1 嗜盐细菌分离培养基的选择
营养琼脂培养基（MA），复合培养基（CM），TSA培养基，培养基成分及配制要点见附录A；R2A培养基和海盐琼脂培养基（2216E）可于厂家购买。
6.2.2 嗜盐古菌分离培养基的选择
稀释10倍的复合培养基（CM），改良高氏一号（Cause1）培养基，稀释10倍的改良S-G培养基。培养基成分及配制按附录A。
6.2.3 培养基平板的制备
培养基的配制按照NY/T1114-2006中6的要求进行。培养基平板的制备应符合NY/T2321-2013中5.1.4.1的要求，对于培养古菌的固体培养基要稍厚一些，且制备好的培养基应放置在无菌密封袋中于4℃保存。
6.3 土壤样品的预处理及土壤悬浮液的制备
新鲜土壤样品需进行过2mm孔径筛的预处理，按照NY/T2321-2013中5.1.4.2的要求用系列稀释方法获得不同浓度的土壤悬浮液（菌悬液）。对于不能立即用于微生物分离的新鲜土样应暂存于4℃冰箱中。
6.4 土壤pH和水溶性盐总量的测定
土壤pH和水溶性盐总量的测定分别按照NT/T1377和NT/T1121.16的规定进行。
6.5 菌悬液的加样及培养
6.3中的土壤悬浮液按照NY/T2321-2013中5.1.4.3的要求涂布在制备好的培养基平板上，在30℃～35℃恒温静置培养箱中倒置培养。培养极端嗜盐古菌的平板需要放在大封口袋中，并在袋中放置盛一定量水的烧杯，培养时间7d～10d。
6.6 纯菌株的获得及耐盐性的判断
采用平板反复划线分离法获得纯菌株。挑取6.5中含有不同盐浓度的平板上长出的单菌落划线至新的、且具有同样盐浓度的平板上（确保每次划线都能有单菌落出现，且每次都挑取单菌落转移至下一个新平板），反复操作三次以上，直至在同一平板上长出的菌落大小、形状、颜色、质地、光泽等特征一致，则该菌株为可耐受该盐度的纯菌株。
6.7 注意事项
分离古菌时的注意事项如下：
a) 分离古菌的培养基中不能含DifcoBacto-Peptone蛋白；
b) 分离古菌的培养基中琼脂要先清洗后再加入，具体的方法是：称取16.5g琼脂至蒸馏水中，搅拌5min，放置30min静置沉降琼脂，吸去上清，重复洗涤直到上清液变澄清，然后加水至50mL，再搅拌加入培养液中；
c) 高盐浓度下琼脂容易沉积，而且比普通的培养基更不容易去除气泡，分离古菌的培养基应在灭菌后的较高温度下将琼脂缓慢摇匀再倒平板。

7 分类方法
7.1 工具
小型离心机，微量可调移液器（2.5μL、10μL、100μL、1000μL）及对应的无菌Tip头，细菌基因组DNA提取试剂盒，超净工作台，PCR仪，电泳仪及电泳槽，凝胶成像分析系统。
7.2 模板DNA的提取及其浓度测定
微生物基因组DNA的提取、纯化及其浓度测定按照NY/T2066-2011中5.4和GB/T19495.3的要求进行。
7.3 引物的选择
细菌16S rRNA通用引物：
27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'
1492R：5'-AAGGAGGTGATCCAGCCC-3'
古菌16S rRNA通用引物：
21F：5'-ATTCCGGTTGATCCTGCCGGA-3'
1540R：5'-AGGAGGTGATCCAGCCGCAG-3'
7.4 PCR反应
以同一待测菌株的DNA为模板，分别用细菌引物和古菌引物扩增，扩增出目标片段，且片段大小在1.5kb～1.6kb的为目标菌。反应体系和反应参数按附录B中的B.1和B.2的规定进行，PCR反应的质量控制按照NY/T2006-2011中5.2规定的方法进行。