ICS 65.120
B46
备案号：54426-2017
江苏省地方标准
DB32/T3205-2017

饲料中雪腐镰刀菌烯醇（NIV）的测定免疫亲和柱净化-高效液相色谱法
Determination of nivalenol (NIV) in feed -- High performance liquid chromatography method with immunoaffinity column clean-up

2017-05-05 发布
2017-06-05 实施
江苏省质量技术监督局 发布

前言
本标准按GB/T 1.1—2009《标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写》编写，由南京农业大学提出。本标准起草单位：南京农业大学。本标准主要起草人：张海彬、吴文达、施志玉、郑亚婷、贾惠、李荣佳、张杰、赵秀美。

1 范围
本标准规定了饲料中雪腐镰刀菌烯醇（NIV）检测的制样、免疫亲和柱净化和高效液相色谱检测方法。本标准适用于饲料原料、配合饲料或混合饲料中的雪腐镰刀菌烯醇检测。检测限为2 μg/kg，定量限为10 μg/kg。

2 规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用成为本标准条款。注日期的引用文件，其随后所有修改单或修订版不适用，但鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。不注日期的引用文件，其最新版本适用本标准。
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
GB/T 14699.1—2005 饲料采样

3 原理
液相色谱系统由储液器、泵、进样器、色谱柱、检测器、记录仪等组成。原理是根据样品中各组分在流动相和固定相中溶解度不同而分离。样品与溶剂混合后在高压泵作用下通过毛细管进入色谱柱，在柱中作定向迁移并与流动相作用，多组分样品逐渐分离为单组分，经检测器检测，通过比较分析定性定量鉴定各组分。

4 试剂
凡未指明规格的试剂均为分析纯，水为蒸馏水或去离子水。
4.1 甲醇：HPLC级
4.2 乙腈：HPLC级
4.3 乙酸铵
4.4 乙醇
4.5 高效液相色谱流动相：甲醇-0.1%乙酸铵水溶液（20:80, V/V）
4.6 雪腐镰刀菌烯醇标准溶液：称取适量标品，用甲醇配制0.1 mg/mL标准储备液，避光储存于4℃，用于制备标准曲线，根据需要稀释成标准工作液。

5 设备
5.1 高效液相色谱装置：HPLC，M1706紫外检测器
5.2 Mycosep 227免疫亲和柱
5.3 旋转蒸发仪

6 分析步骤
6.1 样品
饲料原料、配合饲料或混合饲料。
6.2 样品制备
按GB/T 14699.1—2005 饲料采样取得试样800 g，四分法缩减至100 g，磨碎并通过0.90 mm孔径筛。
6.3 毒素提取
称取试样10 g置于150 mL锥形瓶中，加入30 mL乙腈-水（84:16 V/V）振荡30 min，过滤；再加入30 mL乙腈-水（84:16 V/V）振荡提取30 min，收集滤液。
6.4 样品提取液净化
取滤液8 mL，通过Mycosep 227免疫亲和柱净化，收集净化液4 mL于圆底烧瓶，在旋转蒸发仪60℃蒸发至干。加入400 μL乙醇超声溶解，转移至干净进样瓶，用氮吹仪45℃吹干，加入800 μL甲醇-水（20:80, V/V）超声溶解，过滤0.45 μm微孔滤膜后待测。

6.4.1 色谱条件
a) 色谱柱：ODS色谱柱（4.6 mm × 250 mm, 5 μm）
b) 流动相：甲醇-0.1%乙酸铵水溶液（20:80, V/V）
c) 流速：1 mL/min
d) 检测波长：220 nm
e) 柱温：室温
f) 进样量：20 μL

6.4.2 色谱测定
根据样液中雪腐镰刀菌烯醇含量，选取浓度相近的标准工作液。标准工作液和样液响应值应在仪器线性范围内。对标准工作液和样液等体积进样测定，确定保留时间，计算峰面积，绘制标准曲线，根据标准曲线和样液峰面积，得到样液中雪腐镰刀菌烯醇含量，保留一位有效数字。

6.4.3 空白试验
不加试样进行空白试验，与测定平行，采用相同分析步骤。

6.4.4 平行试验
对同一试样进行平行测定。