养殖水体细菌总数测定——荧光显微计数法 DB32/T1730—2011 本标准按照GB/T1.1-2009《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写》进行编写。附录A为资料性附录。 本标准由江苏省海洋与渔业局提出，由江苏省淡水水产研究所起草。主要起草人有杨鸢劫、陈大鹏。 1 范围 本标准规定了荧光显微计数法测定养殖水体细菌总数的试剂、仪器设备、操作步骤、计数方法和计算。本标准适用于养殖水体细菌总数的测定，也适用于环境水域的细菌测定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的： GB/T4789.28 食品卫生微生物学检验、染色法、培养基和试剂 GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T18088 出入境动物检疫采样等。 3 原理 细菌组织细胞经阳离子荧光探针——吖啶橙（Acridine Orange, Ao）荧光色素染色后，与蛋白DNA/RNA相结合。在生物荧光显微镜下，活菌细胞和死菌细胞分别产生黄绿色到绿色荧光和橙色到红色荧光。镜检时，可以计数活菌细胞、死菌细胞和总菌数。 4 试剂 所用试剂除特别说明外，均为分析纯（AR）。无菌水为经0.2μm滤膜过滤的双蒸去离子水，符合Ⅰ级水的规格。 4.1 甲醛溶液（40%） 4.2 萘啶酮酸溶液（0.002%） 4.3 酵母膏溶液（0.025%） 4.4 氢氧化钠溶液（4%） 4.5 磷酸盐缓冲液（pH 7.2±0.05） 4.6 吖啶橙染色溶液（0.1%） 4.7 苏丹黑B溶液 4.8 0.5mol/L 碳酸盐缓冲液 (pH 9.0~9.5) 4.9 缓冲甘油封片剂 5 仪器与设备 5.1 荧光显微镜，配备落射汞灯装置、摄像转换器及监视器，滤光片组：450~490nm激发，520nm屏障，目镜（10×），油镜物镜（100×）。 5.2 电子天平，感量0.0001g。 5.3 电位pH计。 5.4 超净工作台。 5.5 高压灭菌锅。 5.6 采样瓶，50mL螺盖聚丙烯塑料瓶。 5.7 醋酸纤维滤膜：25mm，孔径0.22μm。 5.8 过滤器（包含抽滤管）。 5.9 量筒（容量20mL）。 5.10 镊子（平头）。 5.11 酒精灯。 5.12 载玻片：25.4mm×76.2mm（长×宽），厚0.80mm。盖玻片：18.0mm×18.0mm。