ICS07.100.99
DB15/T1849—2020
内蒙古自治区地方标准
动物垫料中大肠菌群检测
Detection for coliforms in animal bedding
2020-02-25发布，2020-03-25实施
内蒙古自治区市场监督管理局

前言
本标准按照GB/T1.1-2009的规则起草，由中华人民共和国呼和浩特海关提出并归口。起草单位包括中华人民共和国呼和浩特海关、鄂尔多斯市动物疫病预防控制中心、内蒙古自治区农牧业科学院。主要起草人：赵治国、延涵、崔强、王海艳、于志超、陈林军、敖威华、张晓东、盛万里、罗晓平、李军燕。

1 范围
本标准规定了动物垫料中大肠菌群的MPN计数法和平板计数法，适用于动物垫料中大肠菌群的定量检测。

2 规范性引用文件
下列文件对于本标准的应用是必不可少的。注日期的引用文件仅适用于所注日期的版本，不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有修改单）适用。
- GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法
- GB/T8170 数值修约规则与极限数值的表示和判定
- SN/T1538.1 培养基制备指南第1部分：实验室培养基制备质量保证通则
- SN/T1538.2 培养基制备指南第2部分：培养基性能测试实用指南

3 术语和定义
3.1 animal bedding（动物垫料）：用于吸收动物排泄物，使动物保持舒适生活环境的铺垫物，包括动物笼内非直接与动物接触的铺垫物。
3.2 大肠菌群（coliforms）：在培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌。
3.3 most probable number (MPN)（最可能数）：泊松分布的一种间接计数方法。
3.4 colony forming unit (CFU)（菌落形成单位）：在琼脂平板上培养形成的每一个菌落，是计算细菌或霉菌数量的单位。

4 检验原理
4.1 MPN计数法：统计学和微生物学结合的定量检测方法，样品经系列稀释培养后，根据最低未生长稀释度和最高生长稀释度，通过统计学概率推算样品中大肠菌群最大可能数。
4.2 平板计数法：大肠菌群在固体培养基中发酵乳糖产酸，在指示剂作用下形成可计数的红色或紫色菌落，可带有沉淀环。

5 仪器和设备
5.1 恒温培养箱：36℃±1℃
5.2 冰箱：2℃~5℃
5.3 恒温水浴箱：46℃±1℃
5.4 天平：感量0.1g，0.0001g
5.5 均质器
5.6 漩涡混合器
5.7 高压灭菌器
5.8 菌落计数器
5.9 无菌试管：18mm×180mm
5.10 无菌吸管：1mL（0.01mL刻度）、10mL（0.1mL刻度）或微量移液器及吸头
5.11 无菌滤膜均质袋
5.12 无菌锥形瓶：500mL
5.13 无菌量筒
5.14 无菌规格板：5cm×5cm
5.15 无菌培养皿：15mm×90mm
5.16 无菌棉签
5.17 无菌镊子
5.18 无菌剪刀
5.19 无菌勺
5.20 pH计或pH比色管或精密pH试纸

6 培养基和试剂
6.1 实验用水：符合GB/T6682要求
6.2 月桂基硫酸盐胰蛋白肉汤（LST）：附录A.2
6.3 煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB）：附录A.3
6.4 结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）：附录A.4
6.5 无菌磷酸盐缓冲液：附录A.5
6.6 无菌生理盐水：附录A.6
6.7 NaOH溶液（1 mol/L）：附录A.7
6.8 HCl溶液（1 mol/L）：附录A.8

7 MPN计数法
7.1 采样
7.1.1 采样原则：样品采集应遵循随机性、代表性原则，并遵守无菌操作程序，防止外来污染。
7.1.2 颗粒状或粉末样品：对包装内不同部位进行随机多点取样至少250g，混匀后称取25g样品，加入225mL无菌稀释液（磷酸盐缓冲液或生理盐水），充分振摇或均质1~2分钟，制成1:10样品匀液。
7.1.3 平面样品：在平面垫料表面放置灭菌规格板（5cm×5cm），用浸有无菌稀释液的工具取样。