DB37/T3573—2019 生支原体诊断技术规程 (Code of Practice for the Diagnosis of Mycoplasma bovis)
发布日期：2019-05-29
实施日期：2019-06-29
发布单位：山东省市场监督管理局

前言
本标准按照 GB/T 1.1 起草。本标准由山东省畜牧兽医局提出并监督实施，由山东省畜牧业专业标准化技术委员会归口。
本标准起草单位：山东省农业科学院奶牛研究中心、中国农业科学院兰州兽医研究所、威海市畜牧兽医局。
本标准主要起草人：张亮、杨宏军、解晓莉、孙阳阳、储岳峰、赵国清、程凯慧、楚会萌、刘来兴、杨美。

1 范围
本标准规定了牛支原体诊断技术的术语和定义、试剂及仪器、样品的采集与处理方法、生化鉴定方法、核酸检测方法和操作注意事项等。本标准适用于牛支原体的实验室诊断。

2 规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB 6682—2008 分析实验室用水规格和试验方法
GB/T 14926.8—2001 实验动物支原体检测方法
GB 15981—1995 消毒与灭菌效果的评价方法与标准
GB 19489—2008 实验室生物安全通用要求

3 术语与定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1 牛支原体 (Mycoplasma bovis)：柔膜菌纲支原体目支原体科支原体属，可引起成母牛乳腺炎、犊牛肺炎和关节炎等多种病的病原之一。
3.2 Dienes染色液：一种经典的利用天青美蓝染色检测支原体的染色液。
3.3 类胸膜肺炎微生物培养基 (Pleuropneumonia-Like Organisms medium, PPLO培养基)：该培养基主要成分为牛心汤、酵母浸出物、牛肉膏等，不含精氨酸、酚红、葡萄糖等成分，主要用于多种支原体的分离和培养。

4 试剂及仪器
4.1 试剂
去离子水（符合 GB 6682—2008 的相应要求）；牛支原体检测培养基所需试剂及配制方法见附录A；Taq DNA聚合酶及其反应缓冲液；生理盐水；Dienes染色液；TAE电泳缓冲液；琼脂糖。
4.2 仪器
接种环、酒精灯、移液器（5～100μL 和 100～1000μL）、枪头（200μL 和 1mL）、培养试管（15mL）和玻璃培养皿（90mm）、CO2恒温培养箱、1L容量瓶、核酸扩增仪、电泳仪、高压灭菌锅、正置光学显微镜。

5 样品采集与处理
5.1 疑似牛支原体感染牛只的判断
5.1.1 肺炎型：主要表现为咳嗽、喘，有清亮或黏性鼻液，伴随出现关节炎或角膜结膜炎。不同病死牛只的病变差异较大，通常病牛心叶及部分隔叶有局部红色肉样变，或同时有化脓灶散在分布。
5.1.2 乳腺炎型：主要表现为临床型乳腺炎和隐性乳腺炎。前者乳汁带血或呈灰色；后者体细胞数较高，无明显临床症状，但多数情况下单纯感染无明显的红肿热痛。
5.1.3 关节炎型：主要表现为犊牛膝关节肿大、跛行，关节液呈淡黄色或浓稠，常与肺炎性伴随发生。
5.2 疑似病例样品的采集
根据“5.1”所述牛支原体感染的三种临床表现型，分别进行样品的采集，具体要求如下：
a) 肺炎型：应采集新病死牛只的肺部实变部分或病牛的鼻腔液，置专用采样器或无菌容器中；
b) 乳腺炎型：采集前，应弃病牛的前三把奶，再采集病牛乳汁约15mL，置注射器或无菌容器中；
c) 关节炎型：对采集部位进行消毒后穿刺吸取关节液约2mL~5mL，置注射器或无菌容器中。
5.3 样品处理
5.3.1 组织样品的处理：将组织剪至云雾状后，用2mL生理盐水重悬，7500g离心5min，用注射器吸取1mL上清液经0.45μm滤膜滤过后备用。
5.3.2 鼻拭子的处理：用2mL生理盐水浸润后，7500g离心5min，吸取1mL上清液经0.45μm滤膜滤过后备用。
5.3.3 奶样或关节液样品的处理：分别取1mL原液与1mL生理盐水充分混合，7500g离心5min，用注射器吸取1mL上清液经0.45μm滤膜滤过后备用。

6 微生物学检测法
6.1 液体培养
将0.5mL“5.3”所述处理所得上清液加入到含4.5mL PPLO液体培养基的试管中，置于37℃、5% CO2培养箱中培养3天。选择PPLO液体培养基由红色变为黄色且透亮的培养液用于进一步检验。
6.2 菌落形态观察