ICS65.120 B05 DB41 河南省地 方 标准 DB41/T1729—2018 饲料添加剂葡萄糖氧化酶活力的测定分光光度法 2018-11-26发布 河南省质量技术监督局 2019-02-26实施 发布 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准由河南省畜牧局提出并归口。DB41/T1729—2018 本标准起草单位：河南海瑞正检测技术有限公司、河南牧业经济学院、河南省粮油饲料产品质量监督检验中心、河南省兽药饲料监察所、河南省粮油科学研究所有限公司。本标准主要起草人：李贤、曹明月、文英会、侯林丛、高海军、魏广辉、谭旭信、刘文杰、周江滨、王莉莉。 1范围 DB41/T1729—2018 饲料添加剂葡萄糖氧化酶活力的测定分光光度法本标准规定了测定饲料添加剂葡萄糖氧化酶活力的分光光度方法本标准适用于饲料添加剂、混合型饲料添加剂及其复合酶。本方法的定量限为60U/g。规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。3.1 葡萄糖氧化酶活力 在30℃、pH为6.0的条件下，每分钟能把1μmo1的葡萄糖氧化成β-D-葡萄糖酸和过氧化氢所需的酶量，定义为一个葡萄糖氧化酶活力单位（U）。4原理 在葡萄糖氧化酶的作用下，葡萄糖发生氧化反应，生成葡萄糖酸和过氧化氢，过氧化氢与无色的还原型4-氨基安替比林和苯酚在辣根过氧化物酶的催化作用下，生成红色的醒亚胺，生成醒亚胺的量与反应液中葡萄糖氧化酶的活力成正比。通过分光光度计比色测定反应液的吸光度，计算出葡萄糖氧化酶的活力。 5试剂或材料 5.1磷酸缓冲溶液（pH6.0）：分别称取12.1g水磷酸二氢钠和2.189g（精确至0.001g）二水磷酸氢二钠，加入约800mL水，完全溶解后调节pH为6.0土0.02，定容至1000mL。5.2葡萄糖溶液（180g/L）：称取18.0g无水葡萄糖，用磷酸缓冲液（5.1）溶解，定容至100mL。5.34-氨基安替比林溶液（50g/L）：称取5g4-氨基安替比林（精确至0.001g），加水溶解，定容至100mL，棕色试剂瓶存放。 5.4苯酚溶液（11g/L）：称取1.1g苯酚（精确至0.001g），加水溶解，定容至100mL。5.5辣根过氧化物酶（HRP）液：称取0.0015g（精确至0.0001g）辣根过氧化物酶于5mL离心管中，加入3mL水溶解，备用。 注：除非另有说明，试剂均为分析纯，水为GB/T6682中规定的三级水。6仪器设备 6.1分样筛：孔径为0.25mm。 6.2分析天平：感量0.1mg。 6.3pH计：精度为土0.01。 6.4磁力搅拌器：附加热功能。 6.5恒温水浴锅：30℃。 6.6秒表：每小时误差不超过5S。6.7分光光度计：吸光度500nm。6.8离心机：离心力不低于为2000g。试验步骤 7 7.1试样酶液的制备 DB41/T1729—2018 固态试样应粉碎或充分碾碎，过0.25mm孔径筛。称取1g试样两份，精确至0.0001g，分别置于200mL锥形瓶中，加入50mL磷酸缓冲溶液（5.1）。摇床或磁力搅拌提取30min，上离心机4000r/min离心5min，取上清液，上清液再用缓冲溶液（5.1）做二次稀释，使稀释后的待测酶液中葡糖糖氧化酶活力控制在6U/mL10U/mL之间。 7.2测定 取3支试管，分别移取0.2mL辣根过氧化物酶液（5.5），加入4mL磷酸缓冲液（5.1），振摇3s，加入0.6mL葡萄糖溶液（5.2），振摇3S，加入0.8mL苯酚溶液（5.4），振摇3S，再加入0.2mL4-氨基安替比林溶液（5.3），振荡混匀。30℃土0.2℃水浴5min，取出。向其中1支试管中加入0.2mL水，作为空白调零。向另外2支试管中加入0.2mL试样溶液，振荡混合，立即用1cm比色皿，在500nm处测定吸光度为Ao，再准确反应1min后，读取吸光度值Al，得出△A=Ai-Ao。3试验数据处理 8 试样稀释液中葡萄糖氧化酶活力以Xo表示，单位为酶活力单位每毫升（U/mL），按式（1）计算：X。= 式中： f B t A d 887 酶液稀释倍数； 反应液体积（mL）： AAxfxB 887×txAxd 酶解反应时间，单位为分（min）：加入样品体积（mL）： 比色皿的厚度（cm）： 消光系数（L·moL·cm\）； x1000 (1) . X。值应在6U/mL～10U/mL之间。如果不在这个范围内，应重新选择酶液的稀释度，再进行分析测定。 试样葡葡萄糖氧化酶的活力以X表示，单位为酶活力单位每克（U/g)或者酶活力单位每毫升(U/mL)，按式（2）计算： X=X.xn 2 （2） 9 式中： Xo n DB41/T1729—2018 试样稀释样中葡萄糖氧化酶活力，单位为酶活力单位每毫升（U/mL）：试样的总稀释倍数： 计算结果保留三位有效数字。 精密度 在重复性条件下，两次独立测定结果的相对误差不超过8%。3