ICS 11.220 B41 备案号：44107-2015 DB21/T2357-2014 辽宁省地方标准 A型口蹄疫病毒核酸RT-PCR检测方法 RT-PCR assay for Foot-and-mouth disease virus serotype A nucleic acid 2014-07-29发布 2014-09-29实施 辽宁省质量技术监督局 发布 前言 本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。本标准由辽宁省动物疫病预防控制中心提出，由辽宁省畜牧兽医局归口。本标准起草单位：辽宁省动物疫病预防控制中心、辽宁省动物医学研究院。本标准主要起草人：顾贵波、王宏燕、曹东、薛树山、杨作丰、石霖、杨本勇、王红魁、王克才、吴运谱、郑洪玲、闫海滨、马永春、王国庆。 1 范围 本标准规定了A型口蹄疫病毒（FMDV-A）RT-PCR检测方法的技术要求。本方法适用于检测偶蹄动物的水疱皮、水疱液、淋巴结、脊髓等组织样品及食道-咽部分泌物（O-P液）。 2 规范性引用文件 本文件引用相关实验室用水规范及口蹄疫诊断技术规范等标准。凡注明日期的文件，仅所注版本适用；未注明日期的文件，其最新版本适用。 3 缩略语 FMDV-A：A型口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus serotype A） O-P：食道咽部分泌物（Oesophagus-pharyngeal） DEPC：焦炭酸二乙酯（Diethyl pyrocarbonate） EDTA：乙二胺四乙酸（Ethylene Diamine Tetraacetic Acid） DNA：脱氧核糖核酸 RNA：核糖核酸 cDNA：互补脱氧核糖核酸 RT-PCR：反转录-聚合酶链式反应 PCR：聚合酶链式反应 EB：溴化乙锭（Ethidium bromide） TAE：Tris-Acetate-EDTA缓冲液 PBS：磷酸盐缓冲液 Taq DNA polymerase：Taq DNA聚合酶 4 原理 FMDV是一种RNA病毒，其RNA经反转录生成cDNA后可作为PCR扩增模板。根据FMDV-A保守基因序列设计特异性引物，在Taq DNA聚合酶作用下，通过变性、退火和延伸循环，实现体外DNA扩增。 5 实验器材 包括眼科剪、眼科镊、1.5 mL灭菌离心管（DEPC处理）、0.2 mL PCR管、量筒、锥形瓶、吸头、分析天平、低温高速离心机、PCR仪、电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统、冰箱、微波炉、组织研磨器及微量移液器等。 6 试剂 6.1 TRIzol RNA提取试剂或同类商品化试剂。 6.2 氯仿、异丙醇、无水乙醇。 6.3 1%琼脂糖凝胶。 6.4 溴化乙锭（EB，10 μg/L）溶液。 6.5 50×TAE电泳缓冲液。 6.6 焦炭酸二乙酯（DEPC）处理相关试剂。 6.7 DNA分子量标准（DL2000 Marker）。 6.8 75%乙醇。 6.9 上样缓冲液。 6.10 1×TAE电泳缓冲液。 6.11 PBS缓冲液（0.01 mol/L，pH 7.2）。 6.12 50%甘油磷酸盐缓冲液。 6.13 商品化RT-PCR反应试剂体系，包括AMV反转录酶、RNA酶抑制剂、Taq DNA聚合酶、MgSO4、dNTP等组分。