ICS 65.020.01 B05 DB21/T2341-2014 辽宁省地方标准 马铃薯种薯（种苗）病毒多重RT-PCR检测技术规程 2014-07-05发布 2014-09-05实施 辽宁省质量技术监督局 发布 前言 本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。本标准由沈阳市农业科学院提出，由沈阳市质量技术监督局归口。本标准起草单位：沈阳市农业科学院、辽宁省农业科学院、铁岭市农产品质量安全检验检测中心。本标准主要起草人：杨双、潘菊、左丽君、岳玲、王辉、李金凤、马东梅、刘延斌、孙嘉兴、李雪。 1 范围 本标准规定了马铃薯种薯（种苗）的总RNA提取、多重RT-PCR扩增、电泳检测及结果判定的方法和操作规程。本标准适用于马铃薯Y病毒和马铃薯A病毒的检测。 2 规范性引用文件 本文件引用相关标准，包括GB 18133-2012《马铃薯种薯》、GB/T 29377-2012《马铃薯脱毒种薯级别与检验规程》等。 3 术语和定义 3.1 马铃薯Y病毒（PVY）：属于Potyvirus属，病毒粒体呈线形，长度约730 nm，在马铃薯上引起花叶或坏死症状，寄主范围较广，其基因组为单链正义RNA。 3.2 马铃薯A病毒（PVA）：同属Potyvirus，病毒粒体线形，长度约730 nm，寄主范围较窄，在马铃薯上多表现为轻微花叶或无症状感染。 3.3 DEPC水：经焦碳酸二乙酯处理并灭菌的无RNA酶纯水，用于RNA相关实验。 3.4 RT-PCR：反转录-聚合酶链式反应，通过将RNA反转录为cDNA后进行PCR扩增的技术。 3.5 cDNA：与RNA互补的DNA，可形成单链或双链结构，用于后续分子检测分析。 4 原理 马铃薯Y病毒和马铃薯A病毒为单链正义RNA病毒。通过提取植物组织总RNA，经反转录生成cDNA，以特异性引物进行多重RT-PCR扩增目标片段，并通过琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，从而判断样品是否感染相应病毒。 5 仪器设备及试剂 5.1 仪器设备：PCR仪、电泳槽、电泳仪、电子天平、微量移液器、恒温水浴锅、磁力搅拌器、高速冷冻离心机、紫外成像系统、高压灭菌锅、pH计等。 5.2 试剂：EDTA-Na₂、Tris、硼酸、盐酸、CTAB、NaCl、LiCl溶液、NaOH、β-巯基乙醇、无水乙醇、M-MLV反转录酶、Oligo(dT)、dNTPs、RNase抑制剂、Taq PCR Mix、引物、DEPC水、琼脂糖及染料等。 5.3 溶液配制：相关溶液配制方法见附录A。