本标准规定了食品中大肠菌群的LTSE快速诊断标准方法和判断结果原则。本标准适用于各种食品，餐具和各种饮用水的大肠菌群快速测定。本标准方法检出的大肠菌群的含量，表明被粪便污染的程度，而且间接地表明有肠道致病菌存在的可能性。 WS/T 116-1999 食品卫生微生物学检验大肠菌群LTSE快速检验方法 WS/T116-1999 标准下载解压密码：www.bzxz.net

中华人民共和国卫生行业标准
WS/T116-1999
食品卫生微生物学检验
大肠菌群LTSE快速检验方法
Microbiological examinationof foodhygiene-Rapid LTSE method for determination of Coliform bacteria1999-01-21发布
中华人民共和国卫生部发布
1999-07-01实施
WS/T116-—1999
在食品微生物安全监测中，国际上通常采用正常的肠道细菌作为粪便污染指示菌，而不是直接测定肠道致病菌。
本标准是在总结国内外同类技术经验基础上发展起来的，在研制时结合我国国情，设计了适合国内特点，便于基层单位推广应用的一种新的快速简便检测方法。随着食品工业的高速发展，大肠菌群更是卫生微生物学的一项重要监测指标。根据《中华人民共和国食品卫生法》的要求，企业产品要做到“生产一批、检验一批，合格一批，销售一批（简称四个一）\的重要管理措施，因此寻求一种快速、简易而又准确的检验方法，则是长期以来国内外学者在探索的一项科研工作。“大肠菌群LTSE快速检验方法\的建立是在不影响准确性和特异性的前提下，加快大肠菌群的检出，该方法取样和查MPN检索表的报告方式与国际或国内外通用标准方法相同，但是培养基和检验方法与国际标准和国内外新制定的标准却不同.至目前为止，国际或国外通用检测大肠菌群方法的定义还会包括一些对发酵乳糖产气的非肠杆菌科细菌。本方法能加快目的菌生长，其灵敏度为1～3个/mL大肠菌群，37C15h有初步结果，所创用的这种新的证实试验能进一步排除非肠杆菌科细菌对乳糖发酵产气，因此本标准方法体现了灵敏快速、特异准确、经济简便、提高功效等特点，并且应用范围广泛，与法定常规方法一致，可检测多种食品，是一种有效检测各类样品的快速检验大肠菌群方法，在应用时能节材、省时、省力，减轻检验人员的劳动强度，适合于各级卫生监督单位的监测和食品工业单位的质量检查。
本标准的附录A，附录B都是标准的附录。本标准的附录C是提示的附录。
本标准由卫生部卫生法制与监督司提出。本标准起草单位：湖南省湘潭市卫生防疫站。本标准主要起草人：涂楚国。
本标准由卫生部委托卫生部食品卫生监督检验所负责解释。1范围
中华人民共和国卫生行业标准
食品卫生微生物学检验
大肠菌群LTSE快速检验方法
Microbiological examination of food hygiene-RapidLTSE method fordeterminationof ColiformbacteriaWS/T116-1999
本标准规定了食品中大肠菌群的LTSE快速诊断标准方法和判断结果原则。本标准适用于各种食品、餐具和各种饮用水的大肠菌群快速测定。本标准方法检出的大肠菌群的含量，表明被粪便污染的程度，而且间接地表明有肠道致病菌存在的可能性。
2引用标准
下列标准所包含的条文，通过在本标准中引用而构成为本标准的条文。本标准出版时，所示版本均为有效。所有标准都会被修订，使用标准的各方应探讨使用下列标准最新版本的可能性。GB/T1.1一1993标准化工作导则第1单元：标准的起草与表述规则第1部分：标准编写的基本规定
GB/T4789.3—1994食品卫生微生物学检验大肠菌群测定GB/T5750—1985生活饮用水标准检验法3定义
本标准采用下列定义。
大肠菌群Coliformbacteria
大肠菌群系指一群需氧及兼性厌氧在37C生长时能使乳糖发酵，在本法培养基中15h内产酸产气，氧化酶试验阴性的革兰氏阴性无芽胞杆菌，能符合此定义的细菌除以大肠埃希氏菌属为主外，还包括肠杆菌科的柠檬酸菌属、肠杆菌属和克雷伯氏菌属细菌。这些细菌都存在于人的粪便内，故此作为粪便污染指标来评价食品卫生质量具有广泛的意义。食品中大肠菌群数系以每100mL（g）检样内大肠菌群最可能数（MPN）表示。4原理
不同的细菌以不同途径分解糖类，在其代谢过程中均能产生丙酮酸及转变为各种酸类，大肠菌群能分解乳糖，由于具有甲酸解氢酶作用于甲酸，产生氢和二氧化碳气体，因此气体的产生是在产酸的同时进一步分解酸而形成的。根据这个原理，将样品接种到LTSEBOth内15h，看结果有无产气现象，然后加氧化酶试验和涂片革兰氏染色镜检结果综合判断是否有大肠菌群的存在。中华人民共和国卫生部1999-01-21批准1999-07-01实施
5仪器与材料
5.1高压蒸气灭菌器。
5.2干热灭菌箱。
5.3恒温箱。
5.4天平。
5.5均质器。
5.6显微镜。
5.7冰箱。
5.8接种环。
5.9载玻片。
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5.10试管、童汉氏小管、刻度吸管等，置于干热灭菌箱中160℃灭菌2h。6培养基和试剂
6.1LTSE培养基肉汤(1号）。
6.2氧化酶试剂。
6.3革兰氏染液。
本方法中，除化学纯(BR)生化试剂外，所用的化学试剂为分析纯（AR)；试剂用水为蒸馏水。7检验程序
大肠菌群检验程序如图1所示。
LTSE发醇管
37C±1C15h
不产气
大肠菌群
8操作步骤Www.bzxZ.net
涂片苯兰氏染色
苯兰氏阳性苹兰氏阴性
大肠菌群阴性
无芽驱杆菌
氧化酶试验
大肠菌群阳性
图1大肠菌群检测程序
大肠茵群阴性
8.1检样稀释
8.1.1以无菌操作将检样25mL（或25g）放于含有225mL灭菌生理盐水的无菌瓶内，经研磨或充分振摇溶解成为1：10的均匀稀释液。固体检样最好用均质器，以8000～10000r/min的速度处理1min做成1：10的均匀稀释液。
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8.1.2用1mL灭菌吸管吸取1：10稀释液1mL，注入含有9mL灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内，振摇试管混匀，作成1：100的稀释液。8.1.3另取1mL灭菌吸管，按上项操作依次10倍递增稀释液，每递增稀释一次，换用1支1mL灭菌吸管。
8.1.4根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估计，选择三个稀释度，每个稀释度接种3管。8.2预测试验
将待检样品接种于LTSE发酵管内，接种在10mL或10mL以上者，用双料LTSE发酵管，1mL及1mL以下老，用单料LTSE发酵管。食品样稀释方法同常规方法（GB/T4789.3）采用9管法，每一稀释度接种3管，罩37℃土1℃温管内，培养15h士1h观察结果，如有混浊并产气者，即表示为阳性管。以上阳性管继续按下列程序做证实试验。8.3证实试验
8.3.1菌液涂片：用直径3~4mm的接种环挑取菌液2~3环进行革兰氏染色，镜检，有革兰氏阴性无芽胞杆菌，而杂菌无或少。
8.3.2氧化酶试验：产气管取约0.5~1mL培养物，滴加试剂2~3滴摇匀，显粉红色或深红色示为氧化酶阳性，不变色或呈试剂的本色为阴性反应。9结果判断和报告
如有产气，氧化酶阴性并从形态上见到革兰氏阴性的无芽胞杆菌，表示有大肠菌群存在，然后查MPN检索表，计算MPN值。
食品卫生报告每100mL（g）大肠菌群的最可能数查表1。表1每100mL(g）食品标准中大肠菌群最可能数（MPN）检索表阳性管数
1mL(g)×3
0.1mL(g)X3
0.01 mL(g)X3
100mL(g）
95%可信限
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表1（完）
95%可信限
阳性管数
≥24.000
100mL(g）
0.01m(g)X3
0.1mL(g)X3
1mL(g）×3
表1内所列检样量如改用10mL(g）、1mL(g）和0.1mL(g）表内数字相应降低10倍，如改用0.1mL(g）、表1采用3个稀释度[1mL(g)、0.1mL(g)、0.01ml(g)]，每稀释度3管。0.01mL(g）和0.001mL(g）时，则表内数字相应增加10倍，其余类推。1
A1成分
胰蛋白陈
氯化钠
磷酸氢二钠（无水）
磷酸二氢钾(无水）
微量元素溶液
蒸馏水
A2制法
1000mL
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附录A
（标准的附录）
LTSE培养基肉汤的制备
将上述各固体成分加到蒸增水中，加热溶解，pH为7.0土1冷却后再加微量元素溶液0.5mL，边加边摇匀，分装入有童汉氏小管的试管各5mL。双料成分均加倍，即将上述LTSE肉汤液浓缩二倍配制，分装入内有童汉氏小管的试管各10mL（仅分装30mL的供酱油及酱类检验用），置高压蒸汽灭菌器中，以115℃灭菌20～30min，贮存于4℃冰箱或阴凉处备用。A3用途
大肠菌群的发酵培养基。
A4其他
若做水样采用二倍浓缩LTSE培养基液，其培养基分装试管量和样品量按常规方法（GB/T5750）进行。
附录B
（标准的附录）
LTSE标准方法证实试验的试剂制备B11%盐酸二甲基对苯二胺试液
B1.1配制
称取盐酸二甲基对苯二胺0.1g·溶于蒸馏水10mL即得。此液应新鲜少蛋配制，于冰箱内避光保B1.2用途和结果
供氧化酶试验用。本法阳性者，菌液立刻呈粉红色，并逐渐加深，阴性者菌液不变色或呈该试剂的本B2染液配制
B2.1结晶紫染液
结品紫（cystalviolet）
95%乙醇
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1%草酸铵[(NH)C,O,]水溶液
将结晶紫溶解于95%乙醇中后，与草酸铵溶液相混合，静置48h使用。此染液稳定，置密闭的棕色瓶中可储存数月。
B2.2革兰氏碘液
碘化钾
蒸馏水
先用3~5mL蒸馏水溶解碘化钾，再加碘片，待全部溶解后，加蒸馏水稀释至300mL，置密闭棕色瓶中，备用。
B2.3脱色液：95%乙醇
B2.4沙黄（番红)染液
沙黄（Saframine0）
95%乙酵
蒸馏水
将沙黄溶解于95%乙醇中，待完全溶解再加蒸馏水至100mL。B3染色法
B3.1用直径为3~4mm的接种环沾取产气阳性管的菌液3~4环置于清洁载玻片上，涂片自然风干或微热烤干，而后通过火焰2～3次，以固定涂片。B3.2滴加结晶紫溶液，染色1min，水洗。B3.3滴加碘液，媒染1min，水洗，甩干余水。B3.4滴加95%乙醇脱色约20~30s，或将95%乙醇滴满整个涂片，立即倾去，再用乙醇滴满涂片脱色10s，水洗，吸干（脱色是本法关键技术，脱色不足易染成阳性，脱色过度易染成阴性）。B3.5滴加沙黄复染液，染1min，水洗，待干。B4镜检
B4.1染色结果：革兰氏阳性菌呈蓝紫色，革兰氏阴性菌呈红色。附录C
（提示的附录）
正确使用本标准的说明
C1方法的研制与样品考核结果
C1.1LTSE法的敏感性与特异性
用平板活菌计数LTSE法灵敏度为13个/mL，大肠菌群四个属菌株在LTSE培养基上37C15h出现结果，采用多种常见的非大肠菌群的菌株检测不酵解乳糖产气，经试验证明本法灵敏度高，特异性强，比常规法节约经费82.58%以上。6
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C1.2LTSE培养基的各种成分都是经过了很多试验反复摸索研制成功的，其营养丰富，抑制杂菌效果强，具有加快目的菌生长发育和促进发酵缓慢的大肠菌群产酸产气的效果。在证实试验中增加了氧化酶试验反应具有排除非肠杆菌科对乳糖发酵产气的特殊功能。根据本方法原理不必要加入指示剂，并便于做证实试验。
C1.3本方法研制成功后，经不同的卫生监测单位实验考核各类食品样品共计703件，结果与常规法总符合率为99.3%；而与美国标准（ANSI)A-1快速法比较其特异性与敏感性为优。C2革兰氏染色的涂片检查说明
本方法加有涂片检查，主要是进一步证实大肠菌群的形态，因本方法的LTSE培养基SDS加量大，SDS抑制革兰氏阳性菌效果好而不影响大肠菌群的生长，如果检验人员没有时间，可以省去涂片镜检，结果的可靠性仍在99%以上。
C3操作注意事项及经验介绍
C3.1检样要严格遵守操作规程，避免技术操作的差错。由于大肠菌群是呈分裂繁殖生长，在水中往往具有聚集性，分布不均勾的现象，因此检样前固体和液体样如同常规法（GB/T4789.3)统一步骤经前处理后，注意稀释固体（或液体）样时，要充分溶解摇匀，使其目的菌分布均勾，每取样加入LTSE发酵管要自先混匀，避免或尽量减少取样误差。C3.2培养基灭菌后，童汉氏小管应无气泡方能使用；做氧化酶试验的小试管要清洁干净。C3.3本方法灵敏度高，37℃15h培养与带规符合率基本-致（即99%100%），超过15h可提高检出率。
C3.4初次观察试管法氧化酶试验难以辨别真假阳性结果，可采用氧化酶阳性结果的非肠杆菌科菌株做阳性对照，如绿脓杆菌、脑膜炎双球菌，孤菌科菌株等等。中华人民共和国卫生
行业标准
食品卫生微生物学检验
大肠菌群LTSE快速检验方法
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开本880×12301/16印张3/4
字数16千字
1999年8月第一版 1999年8月第一次印刷印数1-1200
标日380-52
6661-9111/
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