本标准规定了全血中血红蛋白测定的方法、结果的表达及氰化高铁血红蛋白标准物。本标准适用于临床实验室的常规检验。 WS/T 122-1999 全血中血红蛋白的测定 WS/T122-1999 标准下载解压密码：www.bzxz.net

备案号：929-2000
中华人民共和国卫生行业标准
WS/T122—1999
全血中血红蛋白的测定
Quantitativedetermination
of hemoglobininwholeblood
1999-12-09发布
中华人民共和国卫生部发布
2000-05-01实施
WS/T122—1999
全血中血红蛋白测定是一种临床常用试验，需有相应的标准进行规范，本标准因此而制定。本标准从2000年5月1日起实施。本标准由卫生部医政司提出。
本标准由解放军总医院临床检验科负责起草。本标准主要起草人，丛玉隆、邓新立。本标准由卫生部委托卫生部临床检验中心负责解释。1范围
中华人民共和国卫生行业标准
全血中血红蛋白的测定
Quantitative determination
of hemoglobin in whole bloodWS/T122-1999
本标准规定了全血中血红蛋白测定的方法、结果的表达及氰化高铁血红蛋白标准物。本标准适用于临床实验室的常规检验。2定义
本标准采用下列定义。
2.1高铁血红蛋白
铁原子已被氧化成高铁离子的血红蛋白。可用英文缩写H表示。2.2鼠化高铁血红蛋白
铁原子被氧化成高铁离子，高铁离子已同钒离子相结合的血红蛋白。可用英文缩写HiCN表示。2.3总血红蛋白
正常存在人循环血中的所有血红蛋白衍生物，应包括脱氧血红蛋白、氧合血红蛋白、硫化血红蛋白、碳氧血红蛋白和高铁血红蛋白。3检测原理
在溶血液中，血红蛋白（硫化血红蛋白除外）中亚铁离子（Fe+）被高铁鼠化钾氧化成高铁离子（Fes+)，血红蛋白转化成高铁血红蛋白。高铁血红蛋白同氰化钾中的氰离子反应生成钒化高铁血红蛋白。反应应在18～25℃中进行。加入非离子表面活性剂可加快红细胞的溶解，减少脂蛋白沉淀产生的溶液混浊。在仪器上进行测定。化高铁血红蛋白在波长540nm左右有一个较宽的吸收峰，它在540nm处的吸光度同它在溶液中的浓度成正比。标本中血红蛋白的浓度可通过先测得吸光度，然后从标准曲线上按吸光度读取。也可以同时与一标准溶液比色而得出结果。4材料与装置
4.1玻璃器材
要求试验中的玻璃器材准确度为A级，清洁度为化学级。微量吸管和沙利氏吸管要求为20μL士0.1μL，吸量管为0.5mL士0.005mL，移液管为5.0mL士0.005mL或10.0mL±0.03mL。容量瓶100mL±0.08mL或1000mL±0.3mL。4.2试剂
4.2.1试剂组成：
化钾（KCN)，0.050g
高铁氰化钾[K,Fe(CN)。],0.200g;中华人民共和国卫生部1999-12-09批准2000-05-01实施
磷酸二氢钾（KH,PO），0.140g
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非离子表面活性剂，0.5mL~1.0mL加蒸馅水至1000mL。
4.2.2非离子表面活性剂可用TritonX-10o（1mL/L）,Saponic218等。4.2.3试剂应是清亮的淡黄色溶液，不吸收波长大于480nm的光。试剂的pH值在7.0～7.4之间。其用冰点法测量的渗量应在6～7mmol/L之间。要求血红蛋白在5min内完全转化成氰化高铁血红蛋白。如果试剂变混浊，则应弃去。试剂应避光保存在一容量较大且密封的棕色硼硅玻璃瓶中，试剂应保持新鲜，至少1月配制1次。试剂不可冰冻，否则其中的高铁氰化钾会被破坏，加入乙醇、甲醇、乙二醇或甘油可以防止其分解。
4.2.4试剂中的氰化钾为剧毒物质，要注意操作安全。4.3仪器
使用双波长的分光光度计测量最准确，也可使用各种经过校正的光度计和比色计。测量待检标本的血红蛋白浓度，是先测量其在540nm处的吸光度，然后再经过换算所得。仪器必须经过校正。校正的方法是在仪器上测定HiCN标准物，并根据此标准物的光谱特性来对仪器进行调试。校正的主要内容包括：a）工作波长：将标准物放在待测光度计中，从500nm至580nm测量其吸光度，如果最大吸光度在540nm处，则仪器波长准确，否则应对仪器进行调试。在常规工作中，如仪器最大吸光度处的波长在540nm士5nm范围内，也可用此波长作为工作波长，仪器的测量结果也是准确的。b）校正系数，即K值的测试和计算，见10.4.1。c）检测结果的线性：即检查仪器检测HiCN的吸光度是否同HiCN的浓度成正比。将已知浓度的HiCN标准物准确稀释成各种浓度，分别测定其吸光度。然后以稀释液浓度为横坐标，其对应的吸光度为纵坐标进行描点，并通过各点作直线。如测试各点均在直线上，则证实仪器的线性良好。如有个别点不在直线上，作直线时应使直线通过尽量多的点，将不在直线上的点的吸光度与所代表的浓度在直线的吸光度比较，如两者之差在5%以内，则可认为仪器的检测线性符合要求。d）比色杯的厚度及透光性：
1）比色杯的厚度可用标准测量工具进行测量，其结果应精确到0.001cm。2）透光性测定方法如下：溶解0.2mg伊文兰于100mL蒸馏水中，放入所有待测比色杯内，用一比色杯作标准，将仪器读数准确调到50%透光度，将其他比色杯逐一与标准杯比较，读数时应反复交替测定标准杯与待测杯的透光度，尽量减少仪器漂移的影响，比色杯的透光度应在50%T士0.5%以内方为合格，标记比色杯的透光面，以便在以后应用中使同一侧面面向光源。5标本的采集和保存
5.1血液标本的采集
应使用静脉血，但也可使用外周血。如果用外周血，则要采用正确的标本采集方法。静脉血用乙二胺四乙酸二钠（Na，EDTA）抗凝，其比例是1.5mg～1.8mgNazEDTA抗凝1mL血液，并要立即混匀。测定应在标本采集后立即进行，也可在一天内测定完毕。在室温（18～25℃）条件下保存标本1周，其中的血红蛋白值变化不大。标本同检测试剂混合后，产生的HiCN溶液更为稳定。如果保存时间超过6h，则应将HiCN溶液放在避光密封的容器中，置于4～10℃条件下。其测量结果可在6年内无改变。5.2干扰物质
脂血症或标本中存在的大量脂蛋白产生混浊，白细胞增多及球蛋白增多可造成干扰。煤气中毒或大量吸烟引起血液内碳氧血红蛋白(HbCO)增多，也可引起测量值增高。2
6标本的稀释
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按1，251比例稀释血液标本。如果采集的血液用于仪器的标定，则其稀释操作按6.11进行。常规检测标本的稀释按6.1~6.10进行。6.1缓慢匀速吸取20L血液到微量吸管中（不可超过刻度5mm）。6.2用一干纱布将微量吸管的外面擦干净，但不可带出微量吸管中的血液。6.3调整管中的血液到微量吸管的刻度。6.4再用干纱布将微量吸管的外面擦干净。6.5将微量吸管中的血液柱轻微地回吸，血液柱的最下端离微量吸管的最下端约10mm。6.6将微量吸管插入一个盛有5.0mL试剂的试管中，微量吸管插入液面约2.5cm。6.7慢慢地从微量吸管中排出血液标本（血液应扩散到试管的底部）。6.8从试管的上部吸取较为清亮的试剂清洗微量吸管8~10次。微量吸管中所有接触过血液的部分都应清洗。
6.9将试管盖上，颠倒混匀5~6次。6.10稀释过的血红蛋白溶液在室温下放置5min，以保证颜色反应完全。6.11大体积的稀释液的制备，在计算稀释倍数之后，可以用0.4mL或0.5mL的吸量管和100mL的容量瓶进行操作。
7标本的测定
以试剂作空白，在仪器上进行测定，根据仪器对应的曲线读取吸光度。8血红蛋白浓度的测定
8.1根据式（1）计算血红蛋白浓度。ACNX16114.5XF
11.0×1×1000
式中：c——血红蛋白浓度.g/L；A乱—待测血红蛋白溶液在波长为540nm时的吸光度；一血红蛋白单体的分子量：
F——血液的稀释倍数；
11.0——HiCN在波长为540nm时的摩尔吸光度，光径，cm；
1000-—将毫克转换成克所乘的倍数。如果稀释倍数是1：251，光径为1.000cm，则c等于367.7乘以AM所得的值。.(1)
8.2如果光度计上的刻度转换成血红蛋白浓度，那么也可在仪器测量的范围内直接读取血红蛋白浓度。
8.3比色计在同样条件下测定已知浓度的血红蛋白标准液和待检的血红蛋白溶液，可根据式（2)计算出待测血红蛋白溶液的浓度：
A540Xc
式中：c——待检溶液的血红蛋白浓度·g/L：A540—待检溶液在光波长为540nm时的吸光度，c.-—标准溶液的血红蛋白浓度，g/LAs——标准溶液在光波长为540nm时的吸光度。（2）
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8.4从所制备的标准曲线上读取，见11.4。9结果
血红蛋白浓度以g/L形式表达。
10标准曲线的制备
标准曲线通过用试剂稀释一个或多个二级HiCN标准物来制备。常规检测血红蛋白，先将0.02mL血用5mL试剂稀释，然后测定此溶液在波长为540nm时的吸光度，并与用同样方法处理的血红蛋白标准物所测得的吸光度进行比较，从而得出待检血红蛋白浓度。10.1HiCN标准物的血红蛋白值
标准物的血红蛋白的标值乘以稀释倍数，即为所对应的全血的血红蛋白浓度。10-2标准曲线
稀释为四种浓度（200g/L，100g/L，50g/L，25g/L）的血红蛋白标准物溶液，然后分别测定其在540nm处的吸光度。
10.3标准曲线的绘制
以血红蛋白浓度（g/L）为横坐标，其对应的吸光度为纵坐标，在坐标纸上描点。然后过原点处，尽量靠近所描点画一直线，即为标准曲线。10.4将从测定仪器读取的吸光度换算成血红蛋白浓度和K值的定义。10.4.110.3所制定的标准曲线的斜率即为K值，见式(3)。KAs40
·（3）)
式中：A540—标准HiCN溶液在波长为540nm时的吸光度：血红蛋白浓度，g/L。
K值可用于鉴定仪器给出的标准曲线是否有效，也应用于将所测得的吸光度换算成血红蛋白浓度。
10.4.2标准曲线制定过程中，要用四种浓度的血红蛋白标准物。测定这四种溶液的吸光度，用吸光度除以血红蛋白浓度，得出K值，将四个K值取平均值，此平均值同仪器给定的K值之差不应大于0.00003，如超过0.00003，则仪器的标准曲线要重新设定。11氰化高铁血红蛋白标准物
11.1成分
氰化高铁血红蛋白标准物应是氰化高铁血红蛋白的水溶液，其浓度应在0.55g/L至0.85g/L之间，溶液无沉渣。如用献血者血红蛋白制作标准物，献血源的血应无乙肝病毒表面抗原，抗HIV抗体、抗HCV抗体阴性。溶液应无菌。其中舒化高铁血红蛋白含量的定值的误差应在1%的范围之内。11.2光学测量特性
11.2.1标准物HiCN含量的定值应在波长540nm时测定吸光度，然后根据式（4）进行计算：ACNX16114.5
11.0×1.000×1000
式中：c——HiCN浓度g/L：
Ar—一HiCN标准物在波长为540nm时的吸光度；16114.5——血红蛋白单体的相对分子量；-HiCN在波长为540nm时的四分之一吸光系数；11.0
1.000——光径，cm；
（4）
一换算系数
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光径应精确到小数点后3位小数。仪器必须校正好，且在仪器的测量范围内，不吸收散射光。比色杯透过光的面应为平面，且其两内侧面的距离为1.000cm（允许0.5%的误差）。测量温度应是20℃~25℃。
11.2.2标准物的定值由多个参考实验室测定。11.3纯度要求
11.3.1将波长为450nm到750nm的吸收光谱同筑化高铁血红蛋白国际标准物的吸收光谱进行比较，观察其纯度。
11.3.2分别测量标准物在波长为540nm和504nm的吸光度，前者与后者的比值应在1.59和1.63之间。
11.3.3在波长大于710nm的红外区测定其吸光度，以检查其混浊度。其在波长为750nm时的吸光度应小于或等于0.002/cm光径。11.3.4将标准物接种到需氧和厌氧的培养基上，然后分别在22℃和37℃中培养。培养结果应为无菌。11.4标签
标签上必须有生产者的姓名、批号、HiCN浓度、血红蛋白浓度、有效期，而且标明符合安全规定和表明其稳定性的数据。生产者应持续监测标准物的稳定性，且发现问题，应立即通知使用者。11.5包装
标准物应保存于棕色容器内。
11.6保存温度
标准物应放于4~8℃下保存。
中华人民共和国卫生
行业标准
全血中血红蛋白的测定
WS/T122-1999
中国标准出版社出版
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中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷新华书店北京发行所发行各地新华书店经售版叔专有不得翻印
开本880×12301/16印张3/4字数10千字反2000年7月第一次印剃
2000年7月第一版
印数1-1200
标目414-59
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