牛结核病噬菌体检测技术规范 本标准规定了噬菌体生物扩增技术检测牛结核病的定义、设备和仪器、培养基和试剂、检测方法、结果判定及注意事项。适用于牛结核病的疫病普查、监测和诊断。 1 范围 本标准规定了噬菌体生物扩增技术用于检测牛结核病的各项要求，包括设备和仪器、培养基与试剂、样本采集与处理、检测过程、结果判定及注意事项。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的： - NY/T541 动物疫病实验室检验采样方法 3 定义 3.1 噬菌体 噬菌体（Bacteriophage，简称phage）是一种病毒，能够感染细菌、真菌、放线菌或螺旋体等微生物，部分噬菌体能够引起宿主菌的裂解。 3.2 噬菌斑 噬菌斑（plaque）是在人工培养基上，细菌在噬菌体作用下裂解形成的圆形斑。 4 设备和仪器 - 生物安全柜 - 离心机（4000r/min） - 振荡器 - 水浴锅（55℃） - 恒温培养箱 - 有盖离心管（50mL） - 无菌试管（10mL） - 移液管（10mL） - 三角瓶（100mL，500mL） - 移液器及配套吸头（100μL，1000μL） 5 培养基和试剂 培养基和试剂的配制方法见附录A。 6 检测 6.1 样本的采集 样本的采集按照NY/T541进行。 6.2 样本的处理 6.2.1 牛乳：取5mL牛乳放入50mL有盖离心管中，加入10mL的3%NaOH溶液，振荡混匀，室温孵育15分钟。加入灭菌完全培养基至30mL，4000r/min离心15分钟，弃去上清液；再加入灭菌完全培养基至30mL，4000r/min离心15分钟后弃去上清液。加入1mL灭菌完全培养基重悬沉淀物，并无菌转移至10mL无菌试管中。 6.2.2 口鼻分泌物：取2mL牛口鼻分泌物（或保存液中的牛口鼻分泌物棉拭子样品）放入50mL有盖离心管中，处理方法同6.2.1。 6.3 检测 6.3.1 阴性对照：吸取1mL灭菌完全培养基放入10mL无菌试管中，为阴性对照。 6.3.2 阳性对照：取50μL指示细胞溶液，用灭菌完全培养基稀释至1.0×10° cfu/mL，取1mL稀释后的溶液于10mL无菌试管中，为阳性对照。 6.3.3 灭菌双蒸水空白对照：灭菌双蒸水处理方法同6.2.1。 6.3.4 在阳性对照、阴性对照、空白对照及样本管中分别加入100μL噬菌体D29溶液，混匀，水浴锅中孵育2小时。 6.3.5 加入100μL杀病毒剂，充分混匀，室温放置10分钟。 6.3.6 加入8mL完全培养基，混匀。 6.3.7 加入1mL指示细胞溶液，混匀。 6.3.8 将反应管中的内容倒入90mm无菌平皿中，加入8mL冷却至55℃的琼脂培养基，快速混匀，置于室温定型。 6.3.9 平皿倒置于37℃培养箱中培养，18~24小时后判读结果。 7 结果判定 当阳性对照平皿中噬菌斑数目≥20个，阴性对照平皿的噬菌斑数少于10个，且无菌双蒸水空白对照无噬菌斑时，试验成立。受检样品平皿中出现≥20个噬菌斑或多个噬菌斑融合为透明状，判定为阳性；平皿中无噬菌斑或噬菌斑数目<20个，判定为阴性。 8 注意事项 8.1 试验前，所有试剂和样本应恢复至室温。 8.2 加入杀病毒剂后，必须彻底摇匀，以确保完全杀死未进入菌体的噬菌体。 8.3 临床样本可能含有病原体，操作过程中应严格遵守生物安全操作规程，包括正确佩戴手套、防护衣、口罩等。 8.4 检测结束后，实验用品和废弃物应进行高温高压或其他生物安全处理。 附录A（规范性附录） 培养基和试剂配制方法： 将Middlebrook 7H9基础培养基4.7g加入900mL蒸馏水中，充分溶解，补足至1L。