ICS 65.020.01 B04 天津市地方标准 DB12/T504—2014 水稻转基因成分筛查方法 Screening method for genetically modified rice 2014-04-22发布 2014-07-20实施 天津市质量技术监督局发布 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由天津市质量技术监督局提出。本标准起草单位：天津市东丽区产品质量监督检验所、天津市农业质量标准与检测技术研究所。本标准主要起草人：黄凤军、朱珠、易萌、杨炳存、刘文、赵新、李阳、闫荣卿。本标准于2014年4月首次发布。 1 范围 本标准规定了水稻中转基因成分定性PCR筛查的术语和定义、检测方法、结果分析与表述。本标准适用于水稻及其制品中SPS基因、CaMV35S启动子、NOS终止子、Bt基因、NPTII基因和HPT基因的定性PCR筛查检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法 NY/T672 转基因植物及其产品检测通用要求 农业部1485号公告—4—2010 转基因植物及其产品成分检测 DNA提取和纯化 农业部2031号公告—19—2013 转基因植物及其产品检测 抽样 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 SPS基因（SPS gene） 编码蔗糖磷酸合酶（sucrose phosphate synthase）的基因。 3.2 CaMV35S启动子（35S promoter from cauliflower mosaic virus） 来自花椰菜花叶病毒的35S启动子。 3.3 NOS终止子（terminator of nopaline synthase gene） 来自胭脂碱合成酶基因NOS的终止子。 3.4 Bt基因（Bt gene） 来源于苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis），可表达一种杀虫晶体蛋白的基因，常见的Bt基因有cry1Ac基因、cry1Ab基因、cry1Ab/cry1Ac融合基因。 3.5 NPTII基因（NPTII gene） 来源于大肠杆菌（Escherichia coli），编码新霉素磷酸转移酶的基因。 3.6 HPT基因（HPT gene） 来自大肠杆菌或链球菌（Streptomyces hygroscopicus），编码潮霉素磷酸转移酶的基因。 4 检测方法 4.1 试剂和材料 4.1.1 实验用水为重蒸馏水或符合GB/T6682规定的一级水。 4.1.2 琼脂糖。 4.1.3 10g/L溴化乙锭溶液：称取1.0g溴化乙锭（EB），溶于100mL水中，避光保存。注：溴化乙锭有致癌作用，配制和使用时应戴一次性手套操作并妥善处理废液。 4.1.4 10mol/L氢氧化钠溶液：在160mL水中加入80.0g氢氧化钠（NaOH），溶解后再加水定容到200mL。 4.1.5 500mmol/L乙二胺四乙酸二钠溶液（pH 8.0）：称取18.6g乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2），加入70mL水中，再加入适量氢氧化钠溶液（4.1.4），加热至完全溶解后，冷却至室温，用氢氧化钠溶液（4.1.4）调pH至8.0，加水定容至100mL。在103.4kPa（121℃）条件下灭菌20min。 4.1.6 1mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液（pH 8.0）：称取121.1g三羟甲基氨基甲烷（Tris）溶解于800mL水中，用盐酸调pH至8.0，加水定容至1000mL。在103.4kPa（121℃）条件下灭菌20min。 4.1.7 TE缓冲液（pH 8.0）：分别量取10mL三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液（4.1.6）和2mL乙二胺四乙酸二钠溶液（4.1.5），加水定容至1000mL。在103.4kPa（121℃）条件下灭菌20min。 4.1.8 50×TAE缓冲液：称取242.2g三羟甲基氨基甲烷（Tris），先用300mL水加热搅拌溶解后，加100mL乙二胺四乙酸二钠溶液（4.1.5），用冰乙酸调pH至8.0，然后加水定容到1000mL。使用时用水稀释成1×TAE。 4.1.9 加样缓冲液：称取250.0mg溴酚蓝，加10mL水，在室温下溶解12h；称取250.0mg二甲基苯胺蓝，用10mL水溶解；称取50.0g……