ICS 07.080 CCS A40 内蒙古自治区地方标准 DB15/T 2024—2020 牛和水牛源性成分同步检测方法 实时荧光PCR法 Real-time PCR Method for Identification of Cattle and Buffalo Derived Materials 2020-10-20发布 2020-11-20实施 发布单位：内蒙古自治区市场监督管理局 前言 本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。本文件由锡林郭勒职业学院、锡林郭勒食品药品检验检测和风险评估中心提出，由内蒙古自治区肉乳标准化技术委员会（SAM/TC39）归口。本文件起草单位包括锡林郭勒职业学院、锡林郭勒食品药品检验检测和风险评估中心。主要起草人：郭梁、李春冬、郭元晟、其勒木格、徐伟良、刘国强、罗建兴。 1 范围 本文件描述了动物产品（肉、乳）中牛和水牛源性成分的实时荧光PCR检测方法。本方法适用于鲜肉、鲜乳、加工肉制品和加工乳制品中牛和水牛源性成分的定性检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过规范性引用构成本文件必不可少的条款。凡是注日期的引用文件，仅该版本适用于本文件；凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 27403 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 实时荧光PCR（real-time PCR） 在PCR反应体系中加入荧光基团，通过荧光信号积累实时监测整个PCR过程，对未知模板进行定性或定量分析。 3.2 Ct值（cycle threshold） 每个反应管内的荧光信号达到设定阈值所经历的循环数。 3.3 阳性对照（positive control） 使用已知含有牛和水牛源性成分的样品作为阳性对照。 3.4 阴性对照（negative control） 使用已知不含牛和水牛源性成分的样品作为阴性对照。 3.5 空白对照（blank control） 使用等体积灭菌水代替模板DNA作为空白对照。 4 原理 采用不同荧光基团标记牛和水牛特异性探针及质控探针，利用多重实时荧光PCR技术，对从鲜肉、鲜乳、加工肉制品和加工乳制品中提取的DNA进行扩增。在同一反应体系中，同时扩增牛、水牛特异基因及质控基因，并进行多通道荧光检测。质控探针用于监控扩增反应是否正常进行，以避免假阴性结果。通过分析Ct值判断样品中是否含有牛和水牛源性成分。 5 试剂和材料 除另有规定外，所有试剂均为分析纯，实验用水应符合GB/T 6682规定的一级水。 5.1 三氯甲烷 5.2 异戊醇 5.3 异丙醇 5.4 95%乙醇 5.5 75%乙醇 5.6 CTAB提取液 称取10 g CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）、40.6 g NaCl、6.06 g Tris base（三羟甲基氨基甲烷）、3.94 g Na2EDTA（乙二胺四乙酸二钠），加入800 mL水，在65℃水浴中溶解，用HCl调节pH至8.0，加水定容至1000 mL，在121℃条件下灭菌30 min。使用前加入终浓度为2%的β-巯基乙醇。 5.7 乳化剂 量取20 mL Triton X-100（聚乙二醇辛基苯基醚，90%）、125 mL 95%乙醇、855 mL NaCl溶液（0.9 g/L），加水定容至1000 mL，在121℃条件下灭菌30 min。 5.8 PBS缓冲液（磷酸缓冲液） 称取NaCl、0.2 g KCl、1.44 g Na2HPO4、0.24 g KH2PO4，加入800 mL水溶解，用HCl调节pH至7.4，加水定容至1000 mL，在121℃条件下灭菌30 min。 5.9 实时荧光PCR反应混合液 包含1 U～2 U Taq酶、1×PCR缓冲液、2.5 mmol/L～4.0 mmol/L Mg2+、0.2 U～1 U UNG酶、0.2 mmol/L dNTP，也可使用具有相同效果的商品试剂盒。 5.10 引物和探针 牛和水牛源性成分扩增引物和探针见表1。 表1（部分） 名称：正向引物 序列（5'→3'）：TTGAAYTAGGCCATGAAGC 名称：反向引物 序列（5'→3'）：CTTACCTTGTTACGACTTGTCTC 名称：牛特异性探针 序列（5'→3'）：FAM-CTCTCATGTAGCTAGTGCGTTTAAATAGGG-TAMRA 目标基因：线粒体12S rRNA基因 扩增片段长度：120 bp