ICS 65.020.01
B40
DB37
山东省地方标准

DB37/T2031—2012
奶牛DNA亲子鉴定技术规程
Technical Specification for DNA Parentage Identification in Dairy Cattle

2012-02-09 发布
2012-03-01 实施

发布单位：山东省质量技术监督局

前言
本标准按照 GB/T1.1-2009 给出的规则起草。

本标准由山东省畜牧兽医局提出。
本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。

本标准起草单位：山东省农业科学院奶牛研究中心、山东省畜牧总站、山东奥克斯生物技术有限公司。

本标准主要起草人：黄金明、张思聪、瀚志花、李建斌、李荣岭、李秋玲、侯明海、曲绪仙、仲峰。

1 范围
本标准规定了奶牛DNA亲子鉴定的技术方法。

本标准适用于奶牛DNA亲子鉴定。

2 规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件；凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T 6682《分析实验室用水规格和实验方法》
NY/T 1672-2008《绵羊多胎主效基因FecB分子检测技术规程》
SN/T 1193《基因检验实验室技术要求》
SN/T 1917-2007《牛地方流行性白血病聚合酶链反应操作规程》

3 术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。

3.1 亲子鉴定（parentage identification）
利用分子遗传学、生物学及医学的理论和技术判断亲代与子代是否具有血缘关系。

3.2 亲权指数（paternity index，PI）
假设亲代提供生父（母）基因成为孩子生父（母）的可能性与随机亲代提供生父（母）基因成为孩子生父（母）的可能性的比值。

3.3 LOD值
亲权指数的对数值。

3.4 亲权（父、母）相对机会（Relative Chance Paternity，RCP）
表示疑似亲代是真实亲代的机会。

RCP 的计算公式：
RCP = PI /（PI + 1）

式中：
PI——亲权指数。

多个标记累计的 RCP 计算：
累计 RCP = 1 - ∏（1 - RCPi）

式中：
RCPi——第 i 标记的 RCP。

3.5 微卫星（DNA microsatellite）
也称短串联重复序列（STR）或简单重复序列（SSR），是一类广泛存在于真核生物基因组中的 DNA 串联重复序列，其核心序列为 2～6 bp，重复次数通常为 15～30 次。

3.6 多重聚合酶链反应（multiplex PCR）
又称多重引物PCR或复合PCR，是指在同一PCR反应体系中加入两对以上引物，同时扩增多个核酸片段的PCR反应。

4 鉴定原理
利用常染色体微卫星分型技术，选取不同染色体上的微卫星位点，采用多重PCR技术扩增微卫星标记，检测微卫星位点的遗传多态性，分型得出各位点等位基因的大小，通过软件统计分析，确定或排除亲子关系。

5 主要试剂配制
除另有规定外，所用试剂均为分析纯，水为符合 GB/T6682 要求的双蒸水。高压灭菌条件为 1.034×10^5 Pa 压力下蒸汽灭菌 20 min。试剂配制见附录A。

6 主要仪器设备
见附录B。

7 检测方法

7.1 样本采集
静脉采集血样 3～5 mL，采用 ACD 抗凝，4℃或 -20℃ 保存。

对公牛，亦可采集 2～3 剂细管精液，液氮保存。

7.2 DNA提取

7.2.1 血液DNA的提取
用酚-氯仿抽提法从抗凝血和血凝块中提取基因组DNA。抗凝血和血凝块的处理按照 SN/T1917-2007 的规定执行，DNA 的提取按照 NY/T1672-2008 中的规定执行。也可采用商业化DNA提取试剂盒提取DNA。

7.2.2 精液DNA提取
从细管中取出精液放入 1.5 mL 离心管中，加入 500 μL 生理盐水混匀，12000 rpm 离心 1 min，弃除上清液，保留底部白色沉淀。重复上述步骤一次。

加入精子DNA抽提液 400 μL 及 5 μL 蛋白酶K，使用旋涡混合器悬浮，56℃ 消化 10～12 h，至溶液澄清透明；加入 300 μL 苯酚，轻轻混匀，12000 rpm 离心 10 min；小心吸取上清液转至 1.5 mL 离心管中，加入 150 μL 苯酚和 150 μL 氯仿，轻轻混合 5 min；吸取上清液后加入 500 μL 无水乙醇（4℃保存），轻轻颠倒混合；用灭菌枪头挑出白色沉淀，用 1 mL 的 70%乙醇洗涤，晾干后加入 400 μL 双蒸水充分溶解，4℃ 或 -20℃ 保存。

7.3 DNA浓度和纯度检测
按照 NY/T1672-2008 的规定执行。

7.4 引物序列
引物序列参考相关标准和文献执行。