DB22/T1607-2012 化妆品中单核细胞增生李斯特氏菌检测——液相色谱-质谱/质谱法
发布单位：吉林省质量技术监督局
实施日期：2013-01-01
发布日期：2012-12-01

前言
本标准按照GB/T1.1-2009和GB/T20001.4-2001的规则起草，由吉林出入境检验检疫局提出并归口。起草单位：吉林出入境检验检疫局检验检疫技术中心。主要起草人：孟日增、王宁、丁旭、刘韬、宋战均、刘金华、蔡阳、罗雁非。本标准仅供内部使用，不得翻印。

1 范围
本标准规定化妆品中单核细胞增生李斯特氏菌的检测方法，适用于化妆品中该菌的检测和确证。

2 规范性引用文件
下列文件对于本标准的应用必不可少。注日期的引用文件，仅所注日期版本适用；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有修改单）适用。
- GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法
- GB7918.1 化妆品微生物标准检验方法总则

3 试剂和材料
3.1 水：符合GB/T6682的灭菌二级水
3.2 Half-Fraser培养基（见附录A.1）
3.3 Fraser肉汤（附录A.2）
3.4 牛津琼脂（Oxford琼脂，附录A.3）
3.5 ALOA琼脂（附录A.4）
3.6 胰酪陈大豆酵母浸膏琼脂（TSA-YE，附录A.5）
3.7 胰酪陈大豆酵母浸膏肉汤（TSB-YE，附录A.6）
3.8 绵羊血琼脂（附录A.7）
3.9 糖类利用肉汤（鼠李糖和木糖，附录A.8）
3.10 CAMP培养基及试验菌株（附录A.9）
3.11 过氧化氢溶液（附录A.10）
3.12 磷酸盐缓冲液（PBS，附录A.11）

4 仪器和设备
4.1 恒温培养箱：25℃±1℃、30℃±1℃、35℃±1℃
4.2 恒温水浴锅：46℃±1℃
4.3 均质器或灭菌乳钵
4.4 显微镜：10X～100X
4.5 接种环、接种针
4.6 灭菌试管：18mm~180mm
4.7 灭菌吸管：10mL（0.1mL刻度）、1mL（0.1mL刻度）
4.8 灭菌量筒：容量100mL和250mL
4.9 灭菌培养皿：直径90mm~100mm

5 检验程序
单核细胞增生李斯特氏菌检测程序见图1。
检样（10 mL）→初次增菌（Half-Fraser 90 mL，30℃±1℃，24h±2h）→二次增菌（Fraser 10 mL，35℃±1℃，48h±2h）→选择性分离培养基（牛津、ALOA，35℃±1℃，48h±2h）→接种木糖、鼠李糖（35℃±1℃，24h±2h）→纯化、鉴定。

6 操作步骤
6.1 样品稀释液制备：按照GB7918.1规定执行
6.2 增菌培养：初次增菌，取1:10样品稀释液10 mL加入90 mL Half-Fraser液体培养基，置30℃±1℃培养24h±2h。二次增菌，取0.1 mL初次增菌培养物加入10 mL Fraser培养液，置35℃±1℃培养48h±2h
6.3 分离培养：用接种环取初次增菌液表层培养物划线接种于牛津琼脂和ALOA琼脂平板，二次增菌培养物按同样步骤划线接种。置35℃±1℃培养48h，检查平板上可疑菌落。典型菌落描述：牛津琼脂上细小灰色菌落，外围有黑色晕圈；48h后菌落变暗，有绿色光泽，中间凹陷；ALOA琼脂上蓝绿色菌落，圆形规则，直径约1 mm，边缘整齐，有明显不透明晕圈
6.4 糖发酵反应：每种选择性培养基选择≥5个疑似菌落，接种于木糖和鼠李糖发酵管中，35℃培养。