DB37/T4101—2020 苹果轮纹病菌快速检测方法
发布日期：2020-08-31
实施日期：2020-10-01
发布单位：山东省市场监督管理局

前言
本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。本标准由山东省农业农村厅提出并组织实施。本标准由山东省农业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：山东省烟台市农业科学研究院。本标准主要起草人：王英姿、刘保友、汪少丽、王培松、石洁。

1 范围
本标准规定了用环介导等温扩增（LAMP）快速检测苹果轮纹病菌的测定方法。本标准适用于苹果叶片、枝条和果实中苹果轮纹病菌的快速检测。方法检出限：10ng/L苹果轮纹病菌DNA。

2 规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
GB/T 27403 实验室质量控制规范
食品分子生物学检测

3 原理
3.1 扩增原理
根据苹果轮纹病菌的ITS序列中特异性序列设计特异性内、外引物及环引物各一对（特异性序列参见附录A）。三对引物特异性识别靶标序列上的六个独立区域，利用Bst酶启动循环链置换反应，在ITS基因序列启动互补链合成，在同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎-环DNA混合物，加入显色液即可通过颜色变化观察判定结果。
3.2 显色原理
SYBR Green I是一种高灵敏度的DNA荧光染料，可以嵌入方式结合到双链DNA的小沟内。当它与双链DNA结合时，荧光信号是游离状态的800～1000倍。在不发生扩增反应时，SYBR染料分子的荧光信号不发生改变，颜色显现为橙色；当发生扩增反应时，随着双链DNA的增加，SYBR染料的荧光信号也随之大幅度增强，其信号强度可代表双链DNA分子的数量，同时颜色由橙色变为绿色。

4 缩略语
LAMP：环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification）
DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid）
ITS：内转录间隔区（Internal transcribed spacer）
2×Lamp Master Mix：等温扩增PCR混合液
Bst酶：Bst DNA聚合酶（Bst DNA polymerase）

5 试剂和材料
除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯；实验用水为GB/T 6682中规定的一级水。
5.1 等温扩增PCR混合液（2×Lamp PCR Master Mix）：包含40mmol/L Tris-HCl、20mmol/L (NH₄)₂SO₄、20mmol/L KCl（pH值为8.8）、16mmol/L MgSO₄、2.0mmol/L dNTPs、0.2% Triton X-100。
5.2 Bst DNA聚合酶：酶浓度8U/μL。
5.3 显色液：SYBR Green I荧光染料，1000X。
5.4 引物：根据苹果轮纹病菌ITS基因序列设计一套特异性引物，包括外引物1（F3）、外引物2（B3）、内引物1（FIP）、内引物2（BIP）、环引物1（LF）和环引物2（LB）。外引物扩增片段长度为189bp，引物序列见附录A。
5.5 DNA快速提取液：DNA-EZ Reagents Al-DNA-Fast-Out。
5.6 甜菜碱：5mol/L。
5.7 离心管：0.1mL、1.5mL。
5.8 塑料研磨棒：长度70mm，研磨头外径6.2mm，研磨头长度9.5mm。

6 仪器设备
6.1 恒温箱：满足65℃±3℃、80℃±1℃要求。
6.2 移液器：量程0.5μL~10μL，量程10μL~100μL，量程100μL~1000μL。

7 测定步骤
7.1 试验设置
7.1.1 阴性对照：采用不含有目标基因序列的苹果腐烂病菌（Valsamellia）基因组DNA为模板。
7.1.2 阳性对照：采用含有目标基因序列的苹果轮纹病菌（Botryosphaeria dothidea）基因组DNA为模板，浓度应略高于方法检出限。
7.1.3 空白对照：以水代替DNA模板。
7.2 试样采集
进行田间轮纹病菌快速检测时，切取约0.5cm×0.5cm待检测的苹果组织（果实、叶片、枝条），放置于1.5mL离心管中保存并标记。
7.3 试样DNA提取
7.3.1 将100μL DNA快速提取液加入到盛有试样的1.5mL离心管中，用研磨棒研磨5min。
7.3.2 80℃±1℃加热5min；如果是难以破裂的细胞和材料，则保温时间可以延长到10min～30min。
7.3.3 用手振荡混匀后取裂解物直接进行LAMP反应。
7.4 LAMP反应步骤
7.4.1 反应体系
LAMP反应体系见下表。每个试样各做2个平行管。加样时应使试样DNA溶液完全加入反应液中，不要粘附于管壁上。在反应体系配制完成后，将1μL显色液滴于反应管的管盖内侧，盖管盖时应尽量小心防止显色液混合进入反应液中。这样试样扩增反应后不必开盖即可观察颜色变化。
【表1 LAMP反应体系】
组分 | 工作液浓度 | 加样量 | 反应体系最终浓度
外引物1 (F3) | 10μmol/L | 0.5μl | 0.2μmol/L
外引物2 (B3) | 10μmol/L | 0.5μl | 0.2μmol/L
内引物1 (FIP) | 10μmol/L | 2μl | 0.8μmol/L
内引物2 (BIP) | 10μmol/L | 2μl | 0.8μmol/L
环引物1 (LF) | 10μmol/L | 0.5μl | 0.4μmol/L
环引物2 (LB) | 10μmol/L | 0.5μl | 0.4μmol/L
2×Lamp PCR Master Mix | 2x | 12.5μl | 1x
Bst DNA聚合酶 | 8U/μl | 4μl | 0.16U/μL
甜菜碱 | 5mol/L | 1μl | 0.8mmol/L
DNA模板 | - | 4μl | -
水 | - | 补足至25.0μl | -
（注：由生工生物工程（上海）股份有限公司提供，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。）
7.4.2 反应过程
65℃±3℃恒温扩增60min，80℃±1℃持续10min使酶灭活，反应结束。
7.4.3 显色反应
反应结束后，将显色液与反应液上下颠倒轻轻混匀，立即在正常光照条件下于黑色背景（如黑布、黑色纸板）下进行颜色观察。
阴性对照：反应管中液体呈橙色。
阳性对照：反应管中液体呈绿色。
空白对照：反应管中液体呈橙色。
7.5 防污染措施
环介导等温扩增检测过程的防污染措施应符合GB/T 27403中附录D规定。

8 结果判定
8.1 待测样品2个平行样反应管中液体均呈橙色，同时各种实验对照结果正常，可判断该样品检测结果为阴性，不携带苹果轮纹病菌。
8.2 待测样品2个平行样反应管中液体至少一管呈绿色，同时各种实验对照结果正常，可判断该样品检测结果为阳性，携带苹果轮纹病菌。
8.3 若与上述条件不符，则本次检查结果无效，应更换试剂按本方法重新检测。