ICS 65.020 B62 备案号：25092-2009 DB46 海南省地方标准 DB46/T 146—2009 石斛兰、文心兰组培苗繁育技术规程（The Propagation Technological Regulation for Tissue Culture Seedling of Dendrobium & Oncidium） 2009-04-15发布 海南省质量技术监督局发布 2009-04-15实施 本标准由海南省质量技术监督局提出，由海南省林业局归口。 前言 本标准主要起草单位：乐东生态农业开发有限公司、三亚柏盈热带兰花产业有限公司。本标准参与起草单位：海南省林业总公司。本标准主要起草人：邢孔惠、陈运烁、黎冠孝、莫宏奎、刘春梅、莫光武。 1 范围 本标准规定了海南省石斛兰、文心兰组培苗有关的术语和定义、繁育工厂、组织培养快繁技术及检疫等要求。 本标准适用于石斛兰、文心兰种苗繁育。 2 术语与定义 2.1 组织培养（tissue culture） 是指在无菌条件下，创造植物生长最适环境条件，采用人工配制的营养基对离体的植物器官、组织、细胞和原生质体进行培养，最终形成完整植株的过程。 2.2 外植体（explant） 用于离体培养的初始材料称为外植体。 2.3 愈伤组织（callus） 指植物在受伤后或在组织培养过程中通过脱分化而形成的一类薄壁组织。 2.4 原球茎（protocorm） 在某些植物组织培养中，通常不能直接诱导分化出芽苗，而是诱导形成一些扁形球状物，这些球状物在形态上与种子萌发时由胚形成的原球茎相似，因而称为原球茎。 2.5 丛生芽（cluster buds） 由植物器官和愈伤组织发育出来的群体丛生芽苗。 2.6 初代培养（primary culture） 又称诱导培养，指组织培养过程中，将直接从母株采取的最初外植体在无菌条件下进行培养，以期产生不定芽、愈伤组织或原球茎，从而建立无菌培养物的培养阶段。 2.7 继代培养（subculture） 将培养物转移到新的培养基上继续培养的过程。 2.8 实生苗（seedling plant） 将兰科等植物的无胚乳种子播种于人工培养基上使其发芽形成的植物体。 2.9 组培苗（tissue culture seedling） 根据植物细胞全能性，通过组织培养技术，将植物的体细胞、组织或器官进行离体培养，经不同细胞分化途径重建形成不同器官，最终诱导培育出的完整植株。 2.10 玻璃化（vitrification） 试管繁殖材料在不断扩繁过程中，培养物的嫩茎、叶片往往呈半透明、水渍状，这种现象称为玻璃化。 3 种苗繁育工厂 3.1 接种室 主要用于植物材料的消毒和接种、培养物的继代转移等操作的场所。 3.1.1 要求 应为无尘、无对流空气的洁净环境。进入室内的工作人员应换上洁净的工作服、工作帽和拖鞋，避免带入杂菌造成空气污染。 3.2 培养室 用于培养试管苗的场所，室内应保持清洁，内设多层培养架。 3.2.1 培养条件 温度根据种苗品种和培养目的进行调控，一般保持在25℃±2℃；光照强度根据种苗品种和培养目的进行调控，一般为1500～3000 lx，每天光照时间为12～14 h。 3.3 培养仪器设备 主要包括高压灭菌锅、超净工作台、药品柜、冰箱、电炉、电子天平、台秤、搅拌器、pH计、摇床以及烧杯、培养皿、三角瓶、量筒、容量瓶、磨口试剂瓶、滴管、手术刀、镊子、剪刀、接种针、酒精灯等设备。 4 组织培养快繁技术 4.1 母本园的选择 母本园必须为无病虫害、管理正常的兰花园。 4.2 母株的确定 选择品种纯正、农艺性状优良、生长健壮、无病虫害的植株作为母株，并逐株编号及跟踪观察。 4.3 种子无菌播种技术 4.3.1 材料准备及处理 果荚从兰圃取回后，先用洗洁精溶液刷洗表面，再用自来水冲洗干净，移至超净工作台上。先用75%酒精消毒数秒，再用0.1%氯化汞溶液，添加两滴Tween-20灭菌10～15 min后取出，用无菌水彻底冲洗4～5次。将冲洗好的外植体置于无菌牛皮纸或培养皿中，用解剖刀切开果荚，使种子均匀分布于培养基表面。 4.3.2 初代培养 种子在诱导培养基上培养约20天开始萌发，胚逐渐膨大；约45天后胀大的胚呈黄绿色，继续培养，胚表面形成类似原球茎状体的小圆锥体。诱导培养基一般选用KC为基本培养基，附加蔗糖15～20 g/L，并以适量琼脂固化。 4.3.3 继代培养 将诱导阶段形成的原球茎状体转入继代培养基（可采用诱导培养基并添加适量有机添加物）中继续培养。 4.3.4 成苗培养 将继代过程中形成的细弱小苗转入壮苗培养基中培养，并适当添加有机添加物。培养基可采用KC为基本培养基。 4.3.5 生根培养