ICS 67.050 X 04 DB37 山东省地方标准 DB37/T 3123—2018 梧桐花黄酮的提取及其生物活性评价技术规范 Technical Guideline of Phoenix Tree Flower Flavonoid Extraction and Its Biological Activity Evaluation 2018-02-02发布 2018-03-02实施 发布单位：山东省质量技术监督局 前言 本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。本标准由山东省畜牧兽医局提出，由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。本标准由山东农业大学、山东省动物疫病预防与控制中心负责起草。 主要起草人：朱瑞良、胡莉萍、魏凯、孙振红、黄河、郝智慧、闫振贵、王菲。 1 范围 本规范规定了梧桐花黄酮的提取及其生物活性评价的术语和定义、试剂或材料、仪器设备、提取方法、黄酮含量测定及生物活性评价等内容。本规范适用于以梧桐花作为动物用免疫佐剂和免疫增强剂的相关产品。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件；凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有修改单）适用于本文件。 GB/T 603 化学试剂试验方法中所用制剂及制品的制备 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 24863—2010 畜禽细胞体外培养与冷冻保存技术规程 3 术语和定义 3.1 抑菌圈（bacterial inhibition ring） 利用待测药物在琼脂平板中扩散，使其周围细菌生长受到抑制而形成的透明圈。根据抑菌圈大小判定待测药物的抑菌效价。 3.2 最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration, MIC） 在特定环境下孵育24 h，可抑制某种微生物明显生长的最低药物浓度，用于定量测定体外抗菌活性。 3.3 细菌毒力（bacterial virulence） 表示病原体致病能力的强弱，包括对宿主体表的吸附、侵入体内、定居、生长繁殖、向周围组织扩展以及抵抗宿主防御功能和产生毒素等综合能力。 3.4 组织细胞半数感染剂量（50% tissue culture infective dose, TCID50） 指能在半数细胞培养板或试管内引起细胞病变（CPE）的病毒量。 4 试剂或材料 4.1 9日龄SPF鸡胚 4.2 DMEM细胞培养液 4.3 胰蛋白酶 4.4 胎牛血清 4.5 芦丁标准品 4.6 无水乙醇、正丁醇 4.7 去离子水 4.8 生理盐水 4.9 营养琼脂培养基 4.10 营养肉汤培养基 5 仪器设备 5.1 索氏提取器 5.2 旋转蒸发仪 5.3 电子天平 5.4 120目筛 5.5 恒温振荡培养箱 5.6 96孔细胞培养板 5.7 分光光度计 5.8 恒温干燥箱 5.9 恒温培养箱 5.10 灭菌锅 5.11 二氧化碳培养箱 5.12 打孔器（7 mm孔径） 5.13 试管（10 mL） 5.14 烧杯（1000 mL） 5.15 光学显微镜（目镜10×，物镜40×） 6 梧桐花黄酮的提取 6.1 将采集的梧桐花置于60 ℃干燥箱中干燥，粉碎后过120目筛。 6.2 称取1 kg梧桐花粉末（分为若干份）置于索氏提取器中，加入12倍体积60%乙醇，回流提取3次，每次2 h。 6.3 合并滤液，采用旋转蒸发仪减压浓缩，得到乙醇粗提物。 6.4 将乙醇粗提物用6倍体积正丁醇溶解并进行萃取，萃取液经旋转蒸发仪减压浓缩，即得梧桐花总黄酮提取物。 7 梧桐花黄酮含量的测定 7.1 精确称取芦丁标准品30 mg，用95%乙醇溶解，并定容至100 mL容量瓶中，摇匀，得到浓度为0.3 mg/mL的芦丁标准储备液。 7.2 将标准液显色后，用1 cm比色皿在400 nm～700 nm波长范围内进行紫外扫描，确定最大吸收波长为510 nm。 7.3 分别吸取芦丁储备液0、1.00 mL、2.00 mL、3.00 mL、4.00 mL、5.00 mL于6个25 mL容量瓶中，加入5% NaNO₂溶液1.0 mL，摇匀后静置5 min。 7.4 加入10% Al(NO₃)₃溶液1.0 mL，摇匀后静置5 min。 7.5 加入1.00 mol/L NaOH溶液5.0 mL。