ICS 65.020.20 B16 DB51/724—2007 四川省地方标准 水稻细菌性条斑病检验鉴定技术规程 Rule of Detection Method for Xanthomonas oryzae pv. oryzicola 发布日期：2007-11-01 实施日期：2007-12-01 发布单位：四川省质量技术监督局 前言 本标准由四川省农业厅提出并归口。 本标准由四川省农业厅植物检疫站负责起草，重庆大学参加试验。 主要起草人：陈素清、谢成伦、赵兰鸽、吴志平、李堂、王中康、肖连康。 1 范围 本规程规定了水稻细菌性条斑病（Xanthomonas oryzae pv. oryzicola（Fang et al.）Swings et al.）的取样方法、田间症状识别及实验室检验鉴定技术要求。 本规程适用于水稻细菌性条斑病菌的检验和鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准引用而成为本标准的条款： GB 8371-1987《水稻种子产地检疫规程》 GB 15569-1995《农业植物调运检疫规程》 3 术语和定义 3.1 水稻细菌性条斑菌 Xanthomonas oryzae pv. oryzicola（Fang）Swings et al.，指引起水稻细菌性条斑病的病原细菌，属于薄壁细菌门（Gracilicutes）、假单胞菌科（Pseudomonaceae）、黄单胞菌属（Xanthomonas）。 3.2 ELISA（酶联免疫吸附法） 是一种利用酶标记抗体催化底物显色以指示抗原抗体结合的免疫学检测方法。 4 原理 水稻细菌性条斑病菌可侵染水稻植株，并通过带菌种子远距离传播。当带菌量较少时，常规分离培养方法难以检测病原菌。本标准采用血清学酶联免疫吸附法（ELISA）进行检测。 其原理是利用抗原与抗体的特异性免疫反应及酶的高效催化作用形成免疫复合物，当酶标记抗体与底物反应后产生有色产物，通过显色反应判断样品是否带菌。 5 试剂与材料 检验中所用试剂除另有规定外均为分析纯，使用蒸馏水或去离子水。 5.1 样品提取液：磷酸氢二钠、氯化钾、磷酸二氢钾、氯化钠、叠氮化钠溶于蒸馏水并调pH 7.4。 5.2 洗涤液：含吐温-20的磷酸盐缓冲液，pH 7.4。 5.3 无脂奶粉（nonfat dried milk）。 5.4 封闭液：无脂奶粉溶于样品提取液。 5.5 包被液：碳酸氢钠、氯化钠、叠氮化钠溶于蒸馏水，pH 9.6。 5.6 抗体稀释液：无脂奶粉与洗涤液配制，免抗体效价1:10000，稀释度1:100。 5.7 酶标抗体：碱性磷酸酶标记羊抗免抗体。 5.8 底物缓冲液：含氯化镁、叠氮化钠及二乙醇胺，pH 9.8。 5.9 底物溶液：对硝基苯磷酸盐溶于底物缓冲液，避光现配。 5.10 终止液：氢氧化钠溶液。 6 仪器及用具 小型粉碎机、恒温箱、酶联板、微量移液器、放大镜、显微镜、载玻片、盖玻片、容器、吸水纸、小烧杯等。