DB37/T2037-2012 牛白细胞黏附缺陷症（BLAD）基因分子检测技术规程
Technical Specification of Molecular Detection for Bovine Leukocyte Adhesion Deficiency (BLAD) Gene
发布单位：山东省质量技术监督局
实施日期：2012-03-01

前言
本标准按照GB/T1.1-2009的规则起草，由山东省畜牧兽医局提出，并由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。起草单位包括山东省农业科学院奶牛研究中心、山东省畜牧总站、山东奥克斯生物技术有限公司及济南佳宝乳业有限公司。主要起草人为黄金明、张思聪、瀚志花、李秋玲、李建斌、李荣岭、王长法、赵鲲、侯明海、曲绪仙、仲峰。

1 范围
本标准规定了牛BLAD分子检测的技术方法，适用于牛BLAD基因的分子检测。

2 规范性引用文件
下列文件对于本标准的应用是必不可少的。注日期的引用文件，其注日期版本适用；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有修改单）适用。
GB/T6682 分析实验室用水规格和实验方法
NY/T1672 绵羊多胎主效基因FecB分子检测技术规程
SN/T1193 基因检验实验室技术要求
SN/T1917-2007 牛地方流行性白血病聚合酶链反应操作规程

3 术语和定义
3.1 牛白细胞黏附缺陷症（BLAD）
由常染色体上的细胞表面整合素（CD18）基因编码区第383位碱基A→G错义突变引起的隐性遗传缺陷病。

4 检测原理
BLAD发病原因是CD18亚单位第383位碱基由A突变为G。通过PCR扩增突变区域，对扩增产物测序分析，根据测序峰图及碱基序列比对判断基因型，以确认是否携带BLAD基因。

5 主要试剂配制
所用试剂均为分析纯，水符合GB/T6682规定的双蒸水。高压灭菌条件为1.034×10^5 Pa压力，蒸汽灭菌20min。试剂配制见附录A。

6 主要仪器设备
详见附录B。

7 检测方法
7.1 样本采集
静脉采集血样3～5 mL，ACD抗凝，4℃或-20℃保存。公牛亦可采集2～3管精液，液氮保存。

7.2 DNA提取
7.2.1 血液DNA提取
采用酚-氯仿法从抗凝血或血凝块提取基因组DNA，预处理按照SN/T1917-2007执行，提取方法按照NY/T1672-2008执行，也可使用商业化试剂盒。
7.2.2 精液DNA提取
将精液加入1.5 mL离心管，加入500 μL生理盐水混匀，去除蛋白成分，12000 rpm离心1 min，保留沉淀。重复一次后加入精子DNA抽提液400 μL及蛋白酶K 5 μL，56℃消化10～12 h，加入苯酚、氯仿等处理并用无水乙醇沉淀，洗涤后加入双蒸水溶解，4℃或-20℃保存。
7.2.3 DNA浓度和纯度检测
按照NY/T1672规定执行。

7.3 引物序列
上游引物：5'-ATTGACAAGGAAAGAAGTCGTTAC-3'
下游引物：5'-CTGGCACTCCTTCTCCTTGTT-3'
扩增产物长度为874 bp。

7.4 PCR扩增
7.4.1 PCR反应体系
25 μL反应体系：10× Buffer 2.5 μL、550 nmol/C12 1.2 μL、10 mmol/L dNTP 0.6 μL、Taq DNA聚合酶2U、引物各10 μmol/L 1.0 μL、模板DNA 50～100 ng，加双蒸水至25 μL。
7.4.2 PCR循环条件
94℃预变性5 min；94℃变性30 s，59℃退火30 s，72℃延伸30 s，循环；72℃延伸5 min，4℃保存。

7.5 PCR产物检测
使用琼脂糖凝胶电泳检测产物。先用水清洗制胶板，再用1×TAE缓冲液冲洗一次，水平放置，根据电泳胶板规格及样品数量配制1%琼脂糖凝胶。