DB37/T2038—2012 牛尿苷酸合酶缺乏症（DUMPS）分子检测技术规程 2012-02-09发布 山东省质量技术监督局 2012-03-01实施

前言
本标准按照GB/T1.1-2009规则起草，由山东省畜牧兽医局提出，由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。本标准起草单位包括山东省农业科学院奶牛研究中心、山东省畜牧总站、山东奥克斯生物技术有限公司。主要起草人：李荣岭、张思聪、王洪梅、李秋玲、李建斌、黄金明、瀚志花、王长法、侯明海、曲绪仙、仲峰。

1 范围
本标准规定了牛DUMPS分子检测的技术方法，适用于牛DUMPS分子检测。

2 规范性引用文件
本标准适用的必不可少文件包括：GB/T6682-2008 分析实验室用水规格和试验方法，NY/T1672-2008 绵羊多胎主效基因FecB分子检测技术规程，SN/T1193 基因检验实验室技术要求等。注日期文件仅适用所注日期版本，不注日期文件适用最新版本。

3 术语和定义
3.1 尿苷酸合酶缺乏症（deficiency of uridine monophophate synthase）：由于牛体内尿苷酸合酶（UMPS）基因C末端405位点的密码子点突变，使编码精氨酸的CGA转变为终止密码子UGA，引起含有纯合突变基因型的胚胎早期死亡。
3.2 限制性内切酶（restriction endonuclease）：能识别DNA特定序列并切割双链DNA的核酸内切酶。
3.3 限制性片段长度多态性（RFLP, restriction fragment length polymorphism）：基因组上限制性内切酶切位点发生突变或片段长度变化，用于基因突变检测的方法。

4 缩略语
PCR：聚合酶链式反应（polymerase chain reaction）
DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid）
dNTP：脱氧核苷三磷酸（deoxyribonucleoside triphosphate）
bp：碱基对（base pair）

5 检测原理
DUMPS是由于牛UMPS基因C末端405位点的点突变导致的早期胚胎死亡。通过设计针对突变位点的PCR引物进行扩增，并结合RFLP分析，由于野生型与突变型基因片段长度不同，可通过聚丙烯酰胺凝胶的带型判断个体基因型。

6 主要试剂
除另有规定外，试剂均为分析纯，水符合GB/T6682-2008双蒸水标准，高压灭菌条件：1.034×10^5Pa压力，蒸汽灭菌20分钟。试剂及配制方法见附录A。

7 主要仪器设备
主要仪器设备见附录B。

8 检测方法
8.1 样本采集：静脉采集血样3～5mL，ACD抗凝，-20℃保存；公牛可用2～3管精液，-196℃保存。
8.2 基因组DNA提取：
8.2.1 血样DNA提取见附录C。
8.2.2 精液DNA提取见附录D。
8.3 基因组DNA检测：按照NY/T1672-2008执行。
8.4 引物设计与合成：上游引物 5'-GAACATTCTGAATTTGTGATTGGT-3'，下游引物 5'-GCTTCTAACTGAACTCCTCGAGT-3'，扩增产物大小95bp。
8.5 PCR扩增：
8.5.1 PCR体系：总体积20μL，其中10×PCR缓冲液（含15mmol/L Mg2+) 2.0μL，dNTPs 0.5μL，上下游引物各0.5μL，Taq DNA聚合酶1U，DNA模板100ng，加双蒸水至20μL。