DB32/T3685—2019
江苏省地方标准
猪萨佩罗病毒检测技术规程
Detection technical regulation for Porcine Sapelovirus
2019-12-04 发布
江苏省市场监督管理局
2019-12-25 实施

前言
本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由江苏省农业科学院提出并归口。本标准起草单位：江苏省农业科学院。本标准主要起草人：李彬、范宝超、孙杰、何孔旺、郭容利、周金柱、俞正玉。

1 范围
本标准规定了猪萨佩罗病毒的核酸检测（RT-PCR法）、血清学检测（间接ELISA方法）等要求。本标准规定的RT-PCR法适用于本病毒的抗原确诊，间接ELISA试验适用于血清学的普查。

2 规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修订单）适用于本文件。
GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法
NY/T541 动物疫病实验室检验采样方法

3 术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1 猪萨佩罗病毒 Porcine Sapelovirus (PSV)
单股正链RNA病毒，属于小RNA病毒科萨佩罗病毒属。该病毒能引起中度或严重的神经系统紊乱、腹泻、繁殖障碍和肺炎，感染猪康复后仍然会继续排毒，成为重要的病毒传播源，因此该病毒在猪群中感染率很高，严重威胁着养猪业的健康发展。

4 核酸检测（RT-PCR法）
4.1 材料准备
PCR引物：P1 (5'-GAGAAGGTAAAGATGGGCAAAAC-3') 和 P2 (5'-AATACAGGATGACACAGGAAGGG-3')（见附录B）。
PCR相关试剂。
猪萨佩罗病毒阳性病料RNA提取物（作为阳性对照），水（作为阴性对照）。
高速离心机（10000r/min）、PCR仪、电泳仪、水平电泳槽凝胶成像系统（或紫外投射仪）、移液器等仪器。
4.2 操作步骤
4.2.1 DNA模板制备
按NY/T541规定的方法，采集待检猪的病料置于-20℃以下冰箱保存。临床组织病料样品加入1×PBS缓冲液进行充分研磨后冻融3次，高速10000r/min离心5min，取上清提取病毒总RNA（参照RNA提取试剂盒说明书），并反转录成cDNA（利用反转录试剂盒），保存备用。
4.2.2 PCR
PCR反应体系：2×TaqMasterMix 12.5μL，P1 (20pmol/μL) 1.0μL，P2 (20pmol/μL) 1.0μL，模板2μL~5μL，加ddH₂O至总体积25μL。
反应条件：预变性94℃ 5min，94℃ 30s，扩增退火温度采用55℃进行扩增30s，延伸温度采用72℃ 30s，循环35个，最后72℃延伸10min。
4.2.3 电泳
制备1%琼脂糖凝胶，内加适量溴化乙锭或其替代物。取PCR产物10μL～20μL分别与适量加样缓冲液混合后，加样到电泳孔中，9V/cm恒压下电泳15min～30min。将电泳好的凝胶放到紫外投射仪或凝胶成像系统上观察结果。
4.3 结果判定
阳性对照扩增到689bp条带，同时阴性对照无条带时，试验成立。在试验结果成立的前提下，如果样品扩增到689bp条带，可确认为样品为猪萨佩罗病毒PCR阳性。
4.4 废弃物处理和防止污染的措施
检测过程中的废弃物，应做好无害化处理，检测过程中防止交叉污染的措施见附录A。

5 血清学检测（间接ELISA方法）
5.1 材料准备
猪萨佩罗病毒重组3C表达抗原、酶标抗体、标准阴性血清、标准阳性血清、酶标板及其他必要的试验溶液和酶标仪、移液器等仪器。
得检血清样品采集于疑似患病猪场。
5.2 操作步骤
5.2.1 包被：用包被液将猪萨佩罗3C蛋白抗原稀释到工作浓度，加入酶标板孔内，每孔100μL，4℃冰箱过夜。
5.2.2 洗涤：甩掉酶标板孔内的液体，加入洗涤液200μL/孔，室温下浸泡5min，甩去洗涤液，再重新加入洗涤液，连续洗3次，最后一次甩掉洗涤液后，拍干酶标板。
5.2.3 封闭：各孔加入5%的脱脂乳封闭液200μL，37℃作用2h。按5.2.2步骤洗涤4次。
5.2.4 加入待检血清和阴、阳性血清对照：待检血清用稀释液按1:320稀释，每孔加100μL。同时将阴、阳性血清作对照。37℃作用45min，重复5.2.2步骤，洗涤4次。
5.2.5 加入酶标抗体：用稀释液将酶标抗体按1:10000稀释，每孔加入100μL，37℃作用30min，重复5.2.2步骤，洗涤4次。
5.2.6 加入底物：每孔加100μL，室温避光显色8min。
5.2.7 终止反应：每孔加入50μL终止液终止反应。
5.2.8 测定光吸收值(OD)：在酶联免疫检测仪上于450nm波长处测定光吸收值(OD)。
5.3 结果判定
用酶标仪检测OD值，计算S/P值：S/P值 = (样品血清OD450nm值 - 阴性血清OD450nm值) / (阳性血清OD450nm值 - 阴性血清OD450nm值)。当样品S/P值 < 0.150时，判为阴性；样品S/P值 > 0.212时判为阳性；0.150 < 样品S/P值 ≤ 0.212时，判为疑似。